本发明专利技术提供一种用于检测HBB基因位点突变的引物及试剂盒，该引物包括PCR扩增引物和测序引物，所述PCR扩增引物的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述测序引物的序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。该试剂盒包括上述的检测HBB基因位点突变的引物、基因组DNA抽提试剂、检测体系PCR反应液和测序体系试剂。本发明专利技术的检测引物和试剂盒能够检测超过200种HBB基因的位点突变类型，并且可以发现新的位点突变类型。此外，本发明专利技术的检测引物和试剂盒可确定单个β地中海贫血患者携带的HBB基因位点突变。
【技术实现步骤摘要】
一种用于检测HBB基因位点突变的引物及试剂盒
本专利技术属于生命科学和生物检测
，具体涉及一种用于检测HBB基因位点突变的引物及试剂盒。
技术介绍
β地中海贫血(β地贫)是我国乃至全世界最常见的遗传病之一，在我国南方的发病率为0.67％。世界上已发现200多种β地贫突变类型，其中绝大部分是由β珠蛋白(hemoglobinsubunitbeta，HBB)基因的点突变、小的缺失或插入引起β珠蛋白链合成的减少或缺失造成的。我国β地贫的突变类型有48种。HBB基因具有3个外显子和两个内含子，全长1606bp。β地中海贫血的重型无法存活到成年，中间型常无劳动能力，在高发区会严重影响人口质量。此外β地中海贫血的分子病理具有高度的异质性，不同类型的基因缺陷导致患者不同的临床表现，并影响其治疗效果及预后。因此β地贫的产前基因诊断意义重大，并且准确地检测β地贫患者携带的HBB基因位点突变有利于治疗及预后。目前检测HBB基因的点突变、小的缺失或插入最常用的方法是反向点杂交，基于此方法的商业化β地中海贫血基因检测试剂盒大多检测8个常见突变位点和9个少见突变位点，8个常见突变位点是-28(A-G)、-29(A-G)、CD17(A-T)、βE(CD26G-A)、CD41-42(-TCTT)、CD43(G-T)、CD71-72(+A)和IVS-Ⅱ-654(C-T)，9个少见突变位点是-30(T-C)、-32(C-A)、Int(ATG-AGG)、CD14-15(+G)、CD27-28(+C)、CD31(-C)、IVS-Ⅰ-1(G-T)、IVS-Ⅰ-5(G-C)和Cap(-ACCC)。这些试剂盒虽然够检测出90％以上的我国β地贫患者携带的β地贫突变，但是仍然会漏检一些罕见的β地贫突变，例如-31(A-C)、CD8(-AA)、CD71-72(+T)、IVS-Ⅱ-5(G-C)等，而且可能存在一些未被发现的突变类型。已有利用高通量测序技术检测HBB基因位点突变的方法，这些方法虽然能够一次检测多个样本携带的HBB基因位点突变，但无法确定单个样本携带的位点突变，很难应用于临床检测单个β地贫患者携带的HBB基因位点突变。因此必须建立一种高效的全面检测单个β地贫患者携带的HBB基因位点突变的方法，避免漏检、误检。
技术实现思路
鉴于此，有必要针对现有技术存在的问题，提供一种用于检测HBB基因位点突变的引物及试剂盒，可以快速检测β地中海贫血患者携带的HBB基因位点突变。本专利技术的技术方案为：第一个方面，本专利技术提供一种用于检测HBB基因位点突变的引物，包括PCR扩增引物和测序引物，所述PCR扩增引物的序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示，所述测序引物的序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示。进一步的，所述PCR扩增引物扩增HBB基因的外显子、内含子以及上游228bp、下游211bp的侧翼序列，扩增产物为2045bp。第二个方面，本专利技术提供一种用于检测HBB基因位点突变的试剂盒，包括上述的检测HBB基因位点突变的引物和基因组DNA抽提试剂。进一步的，所述试剂盒还包括PCR扩增反应液和Sanger法测序检测试剂。进一步的，所述PCR扩增反应液的组分包括：ddH2O、5×TransStartFastPfuFlybuffer、dNTPs、TransStartFastPfuFlyDNAPolymerase。第三个方面，本专利技术提供一种检测HBB基因位点突变的方法，是采用上述试剂盒，具体过程包括：(1)提取血液或者组织中的基因组DNA；(2)以步骤1中提取的DNA为模板，采用PCR扩增全长HBB基因；(3)对步骤2中的PCR产物进行Sanger法测序；(4)分析测序结果，确定HBB基因是否发生位点突变。本专利技术的优势和有益效果是：(1)本专利技术的检测引物和试剂盒能够检测超过200种HBB基因的位点突变类型，并且可以发现新的位点突变类型。(2)本专利技术的检测引物和试剂盒能够高效特异地扩增HBB基因，并且一次PCR反应就能扩增全长HBB基因，不用分段扩增，可以减少试剂盒的成本；能够准确地检测HBB基因的外显子和内含子中的位点突变，还可以准确地检测HBB基因168bp启动子和164bp终止子中的位点突变。与现有的点杂交法只能检测出有限的位点突变相比，本专利技术的方法能够检测HBB基因外显子、内含子以及上游168bp、下游164bp侧翼序列中的所有位点突变。(3)现有的第二代测序技术虽然能够一次检测多个样本携带的HBB基因位点突变，但无法确定单个样本携带的位点突变，相比之下，本专利技术的检测引物和试剂盒更适合用于确定单个β地中海贫血患者携带的HBB基因位点突变。附图说明图1是本专利技术实施例2中不同扩增条件的PCR产物电泳图，M为Marker，1-6是不同扩增条件的PCR产物，可见4的PCR扩增条件最佳。图2是本专利技术实施例3中4例临床样本的PCR产物电泳图，M为Marker，1-4为检测的临床样本的PCR产物。图3是本专利技术实施例3中HBB基因第1外显子野生型序列的测序结果截图。图4是本专利技术实施例3中应用本专利技术的检测方法检测出的反向点杂交法检测到的全部HBB基因位点突变，其中，a：第1例受试者携带的CD17(A-T)杂合突变；b：第2例受试者携带的IVS-Ⅱ-654(C-T)杂合突变(后面的双峰是IVS-Ⅱ-666(C-T)杂合突变)；c：第3例受试者携带的IVS-Ⅱ-654(C-T)杂合突变；d：第4例受试者携带的CD43(G-T)杂合突变。箭头所示为突变位点。图5是本专利技术实施例3中应用本专利技术的检测方法检测出而反向点杂交法试剂盒检测不到的部分HBB基因位点突变，其中，a：第1例受试者携带的-99(G-A)杂合突变和-96(G-A)杂合突变；b：第1例受试者携带的IVS-Ⅱ-16(G-C)杂合突变；c：第1例受试者携带的IVS-Ⅱ-74(G-C)杂合突变；d：第3例受试者携带的3′UTR+101(G-C)杂合突变。箭头所示为突变位点。具体实施方式在本专利技术的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面结合附图和具体的实施例对本专利技术做进一步详细说明，所述是对本专利技术的解释而不是限定。实施例1本实施例提供一种用于检测HBB基因位点突变的引物和试剂盒。其中，检测HBB基因位点突变的引物是跟据HBB基因的序列设计的特异PCR扩增引物和Sanger法测序引物。该PCR扩增引物扩增HBB基因的外显子、内含子以及上游228bp、下游211bp侧翼序列，其碱基序列为：HBB-F：ATTTGTACTGATGGTATGGGGC(SEQIDNO:1)；HBB-R：CCTTTTCTGAGGGATGAATAAGG(SEQIDNO:2)；PCR产物本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测HBB基因位点突变的引物，其特征在于：包括PCR扩增引物和测序引物，所述PCR扩增引物的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述测序引物的序列如SEQID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种用于检测HBB基因位点突变的引物，其特征在于：包括PCR扩增引物和测序引物，所述PCR扩增引物的序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示，所述测序引物的序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测HBB基因位点突变的引物，其特征在于：所述PCR扩增引物扩增HBB基因的外显子、内含子以及上游228bp、下游211bp的侧翼序列，扩增产物为2045bp。
3.一种用于检测HBB基因位点突变的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1或2所述的检测HBB基因位点突变的引物和基因组DNA抽提试剂。
4.根据权利要求3所述的一种用于检测HBB基因位点突变的试剂盒，其特征在于：所...
【专利技术属性】
技术研发人员：贺俊波，邹翠云，江福能，张蓓，钟惟德，朱建国，黄新珠，
申请(专利权)人：广州辉园苑医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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