一种可持续分泌LAL的载体、脐带间充质干细胞及其构建方法和应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域,具体涉及一种可持续分泌LAL的载体、脐带间充质干细胞及其构建方法和应用。本发明专利技术的可持续分泌LAL的载体包括：CMV增强子、CMV启动子、HSA基因、LAL基因、T2A基因、PuroR基因。其构建方法包括：构建pLVSO2

【技术实现步骤摘要】
一种可持续分泌LAL的载体、脐带间充质干细胞及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
,具体涉及一种可持续分泌LAL的载体、脐带间充质干细胞及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]溶酶体酸性脂肪酶缺乏症(LAL
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D)是由基因突变导致的常染色体隐性溶酶体异常，是一种遗传性、慢性渐进性代谢疾病。各个年龄段都可能患LAL
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D，患者可能出现突发的、不可预测的临床症状，导致身体各组织器官LAL活性显著下降，从而导致胆固醇酯和甘油三酯在肝脏、血管壁和其他组织中慢性的堆积，进而引起患者出现多器官损伤，其中包括肝脏纤维化、肿大、功能衰竭，血清转移酶升高，血脂异常，生长障碍，心血管病等，平均死亡年龄仅为3.7个月。在每100万普通人群中的发病人数不超过20例。LAL
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D治疗包括造血干细胞移植和酶替代治疗，此外降脂他汀类药物可降低高脂血症患者心血管病风险，病情严重时需要肝移植治疗。2015年12月8日，美国食品药品监管局(FDA)批准Kanuma(Sebelipase alfa)用于治疗LAL缺乏症，其主要采用一种针对疾病根源上治疗的酶替代疗法，通过从转基因鸡的卵清蛋白中提取重组LAL，定期静脉注射到患者体内，催化胆固醇酯水解为游离胆固醇，进一步降低低密度脂蛋白、非高密度脂蛋白的数量，而使高密度脂蛋白数量升高；并且促使甘油三酯水解为甘油和游离脂肪酸，游离脂肪酸可释放入血，与白蛋白结合形成脂酸白蛋白运输至其他组织被利用。1项临床Ⅱ期和Ⅲ期的临床试验中接受Kanuma治疗的患者出现31个不良反应事件，比如：发热，呕吐，心动过速，发冷，苍白。此外，造血干细胞移植和肝移植风险较大；商品化重组LAL生物制剂生产工艺复杂，价格昂贵，而且需要定期反复输注，LAL
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D患者不能终身治愈。
[0003]综上所述，LAL
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D的治疗方法主要有造血干细胞移植和酶替代治疗，造血干细胞移植风险较大，酶替代治疗需要长期注射LAL，成本高昂。目前为止，持续分泌LAL的细胞疗法还未见报道。

技术实现思路

[0004]鉴于此，有必要针对上述问题提供一种可持续分泌LAL的载体、脐带间充质干细胞及其构建方法与在人脐带间充质干细胞中的应用，丰富现有LAL
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D治疗方案，克服造血干细胞移植风险以及需要定期反复注射LAL、费用昂贵等缺陷，能较好的解决LAL不能在患者体内可持续分泌表达的问题。
[0005]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0006]一种可持续分泌LAL的载体，包括：CMV增强子(SEQ ID NO：1)、CMV启动子(SEQ ID NO：2)、HSA基因(SEQ ID NO：3)、LAL基因(SEQ ID NO：4)、PuroR基因(SEQ ID NO：5)、T2A基因(SEQ ID NO：6)。
[0007]一种可持续分泌LAL的脐带间充质干细胞，包含所述可持续分泌LAL的载体。
[0008]所述可持续分泌LAL的脐带间充质干细胞的构建方法，操作包括：
[0009](S1)借助PiggyBac转座子构建可持续分泌LAL的转座子载体；
[0010](S2)电转步骤(S1)的LAL转座子载体到脐带间充质干细胞；
[0011]一种可持续分泌LAL的脐带间充质干细胞的构建方法，其步骤(S1)的具体操作包括：
[0012]S11：合成含人HSA基因序列(SEQ ID NO：3)和LAL基因(SEQ ID NO：4)，并插入携带CMV增强子(SEQ ID NO：1)、CMV启动子(SEQ ID NO：2)、T2A基因(SEQ ID NO：6)、PuroR基因(SEQ ID NO：5)的pLVSO2，得到pLVSO2
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HSA
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LAL重组质粒；
[0013]S12：以S11得到的pLVSO2
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HSA
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LAL重组质粒为模板，PCR扩增CMV
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HSA
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LAL
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T2A
‑
PuroR基因序列；
[0014]S13：通过DNA重组技术将S12扩增得到的CMV
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HSA
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LAL
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T2A
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PuroR基因定向插入pT2
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HB转座子载体的多克隆位点，得到pT2
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HB
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CMV
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HSA
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LAL
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T2A
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PuroR
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SV40载体质粒。
[0015]采用CMV增强子、CMV启动子的意义在于，启动外源基因的表达，并且增强外源蛋白表达。
[0016]采用人HSA基因的意义在于，细胞表达的LAL蛋白能够分泌到细胞培养上清中。
[0017]编码PuroR基因的意义在于，筛选出整合了外源基因的阳性克隆细胞。
[0018]采用T2A基因的意义在于，HSA
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LAL和PuroR可以共用一个CMV增强子、CMV启动子，让两个蛋白的表达不受到影响。
[0019]进一步的，所述可持续分泌LAL的脐带间充质干细胞的构建方法，其步骤(S2)的具体操作包括：
[0020]S21：将步骤S13中的重组转座子载体与转座酶载体共同电转到脐带间充质干细胞；
[0021]S22：将电转到脐带间充质干细胞，嘌呤霉素筛选得到稳定的细胞系。
[0022]进一步的，所述嘌呤霉素的作用浓度为0.2μg/mL。
[0023]本专利技术有益效果：
[0024]本专利技术提供了一种可持续分泌LAL的转座子载体；将该转座子载体转染到脐带间充质干细胞，即得到能持续分泌表达LAL的稳定细胞系。运用该细胞系能持续分泌LAL的特性，以期达到运用基因治疗方式治疗溶酶体酸性脂肪酶缺乏症(LAL
‑
D)的目的，并为该载体进一步应用于安全治疗LAL打下基础。转座子载体能装载外源基因容量最大达8kb，能够整合入宿主细胞基因而无任何的足迹。另外，采用了强启动子使得LAL蛋白得以高效率持续、稳定的表达。
[0025]病毒载体虽然能有效地将外源基因整合到宿主基因组中并实现长期表达，但是病毒载体存在可携带的片段较小、成本较高以及安全性等问题，限制了病毒载体的使用。转座子(Transposon)能够在宿主基因组中通过“剪切和粘贴”的机制发生位置的移动，其移动位置的过程称为转座(Transposition)。转座子同样具有促进基因整合到基因组中并实现整合基因长期表达的功能，同时，使用转座子系统仅需将质粒导入细胞中即可发挥转座作用，而且转座子还具有运载容量大和制作成本低等优点。PiggyBac转座子能够携带较大的DNA片段在不同的物种和细胞基因组上发生转座，并且整个过程不会产生任何转座本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可持续分泌LAL的载体，其特征在于，所述载体包括：CMV增强子(SEQ ID NO：1)、CMV启动子(SEQ ID NO：2)、HSA基因(SEQ ID NO：3)、LAL基因(SEQ ID NO：4)、PuroR基因(SEQ ID NO：5)和T2A基因(SEQ ID NO：6)。2.权利要求1所述的可持续分泌LAL的载体的构建方法，其特征在于，所述方法包括：S11：合成含人HSA基因序列(SEQ ID NO：3)和LAL基因(SEQ ID NO：4)，并插入携带CMV增强子(SEQ ID NO：1)、CMV启动子(SEQ ID NO：2)、T2A基因(SEQ ID NO：6)、PuroR基因(SEQ ID NO：5)的pLVSO2质粒，得到pLVSO2
‑
HSA
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LAL重组质粒；S12：以S11得到的pLVSO2
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HSA
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LAL重组质粒为模板，扩增CMV
‑
HSA
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LAL
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T2...

【专利技术属性】
技术研发人员：张娇，邹翠云，朱国栋，江福能，钟惟德，朱建国，
申请(专利权)人：广州辉园苑医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：