一种环状RNA的高效表达方法及表达载体技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，公开了一种环状RNA的高效表达方法及表达载体，克隆环状RNA全长序列至环状RNA表达载体pCRE5(puromysin筛选标记)或pCRE6(copGFP筛选标记)载体；RNA抽提；逆转录；环化检测PCR体系及引物构建。本发明专利技术通过前期的实验验证，构建出能够利用细胞内的相关作用原件实现细胞内环状RNA的准确环化的过表达系统；将环状RNA形成所需的序列原件整合，能够用于多数环状RNA的表达。本发明专利技术仅需要将环状RNA的序列克隆至表达区中就能实现大部分环状RNA的表达；促进了环状RNA形成的序列均来自于人源细胞RNA序列，避免形成的RNA结构被识别为外源序列而被清除。除。除。

【技术实现步骤摘要】
一种环状RNA的高效表达方法及表达载体


[0001]本专利技术属于分子生物学
，尤其涉及一种环状RNA的高效表达方法及表达载体。

技术介绍

[0002]目前，环状RNA是一种普遍存在的首尾共价结合的环状RNA分子，广泛存在于不同物种中。相较于线性RNA分子，环状RNA的环状特殊结构使其具有更高的稳定性。高通量RNA测序(RNA
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seq)和环状RNA特异的生物信息学算法的发展，数以万计的环状RNA已经在人类细胞中被鉴定。后续研究表明环状RNA具有较长的序列和复杂的高级结构，能够通过多种途径，如miRNA海绵或诱饵、蛋白海绵或诱饵、蛋白功能增强器、蛋白脚手架、蛋白招募者、编码功能性多肽等，广泛地参与生物学的各个阶段和病理过程，影响细胞染色质重塑、转录、转录后修饰或信号转导等重要细胞活动中，最终调控组织细胞的生物学反应和细胞命运。尽管已经发现环状RNA能够广泛地影响细胞功能，但在细胞内研究环状RNA的生物学功能及机制还有较大难度，其主要体现在环状RNA细胞内的正确剪接环化需要序列依赖性的顺式作用元件以及调控其精确剪接的反式作用因子。同时，普通环状RNA的过表达系统存在剪接不准确，以及环化效率低等问题，影响环状RNA的细胞功能研究。
[0003]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
[0004](1)在细胞内研究环状RNA的生物学功能及机制还有较大难度，其主要体现在环状RNA细胞内的正确剪接环化需要序列依赖性的顺式作用元件以及调控其精确剪接的反式作用因子。
[0005](2)普通环状RNA的过表达系统存在剪接不准确，以及环化效率低等问题，影响环状RNA的细胞功能研究。
[0006]解决以上问题及缺陷的难度为：细胞内环状RNA表达丰度较低的主要原因为环状RNA形成过程中上下游形成套索结构的难度较大，同时，在环化位点正确剪接的效率较低，两种因素导致环状RNA表达丰度较线性转录本更低。此外，普通的环状RNA表达载体大多将体内环状RNA的侧翼序列直接克隆至表达载体，形成环状RNA必须的套索结构和准确剪接结构的效率较低，导致环状RNA形成效率较低。本环状RNA过表达载体在环状RNA形成的必须原件基础上，对两种原件进行了深度优化。首先，我们将细胞内表达丰度较高的环状RNA CIRS7的上游侧翼序列及其反向互补序列克隆至表达载体pCDH
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CMV
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MCS
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EF1
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PURO多克隆位点，使环状RNA在表达过程中能够形成牢固的套索结构。同时，我们将SLC34A2
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ROS1来源的环状RNA F
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circSR1的上下游50bp内含子序列插入至过表达载体CIRS7互补序列之间，为环状RNA的形成提供了高效的反向剪接序列。针对该设计方法，我们进行了大量的实验，形成了能够高效正确表达环状RNA的表达载体pCRE5。
[0007]解决以上问题及缺陷的意义为：为现有的环状RNA细胞功能研究提供了有力的工具，同时该载体不仅能够进行瞬时转染，还能结合慢病毒包装系统，产生能够实现细胞能稳定过表达环状RNA的慢病毒，大大克服了细胞内环状RNA表达效率低，环化不正确，细胞瞬时
转染效率低，细胞对转染试剂不耐受等问题，短时或长时研究环状RNA均能通过该载体完成。因此，本载体不仅解决了环状RNA正确高效表达的问题，还降低了环状RNA细胞实验门槛，使用户根据实验目的，拥有多样的实验策略。

技术实现思路

[0008]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种环状RNA的高效表达方法及表达载体。
[0009]本专利技术是这样实现的，一种环状RNA的高效表达方法，所述环状RNA的高效表达方法包括以下步骤：
[0010]步骤一，克隆环状RNA全长序列至pCRE5载体,命名为pCRE5
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circRNA；
[0011]步骤二，将pCRE5
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circRNA质粒瞬时转染至目标细胞或包装成慢病毒感染目标细胞，并分别对目标细胞进行RNA抽提和逆转录；
[0012]步骤三，环化引物设计及检测PCR体系构建。
[0013]进一步，步骤一中，所述克隆环状RNA全长序列至pCRE5载体，包括：
[0014](1)PCR扩增F
‑
circSR1全长；
[0015](2)使用Vazyme ClonExpressTM II One Step Cloning Kit将获取的片段与PCRE5载体进行重组连接，将F
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circSR1克隆至环状RNA过表达区之间，命名为pCRE5
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F
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circSR1。
[0016]进一步，步骤(1)中，所述PCR引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
[0017]步骤(2)中，使用Phana酶为Phanta Max Super
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Fidelity DNA Polymerase，50μL反应体系，PCR反应条件为：
[0018][0019]进一步，步骤一中，所述PCR产物回收扩增片段，全长1907bp。
[0020]进一步，步骤二中，所述RNA抽提，包括：
[0021](1)使用Lipo2000将pCRE5
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F
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circSR1质粒瞬时转染至H1299或A549或其他细胞，24h后收获RNA；
[0022](2)提取F
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circSR1过表达细胞RNA：在6孔板细胞中加入Trizol 1mL裂解细胞，充分混匀，室温静置5min；
[0023](3)加200μL氯仿，充分混匀，室温静置3min，1200g 15min 4℃；
[0024](4)取上清约500μL，加入500μL异丙醇，充分混匀，室温静置10min，12000g 10min 4℃；
[0025](5)弃上清，留沉淀，加入1ml 75％的乙醇，混匀，7500g 5min 4℃；
[0026](6)弃乙醇，晾干沉淀，加入DEPC水混匀，立即放冰上；
[0027](7)用1μL RNA测浓度。
[0028]进一步，步骤二中，所述逆转录，包括：
[0029](1)10μL RNA，2μL Random Primer，85℃，3min；
[0030](2)10*RT buffer 2μL，M
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Mlv 1μL，inhibitor 1μL，Rnase free water 4μL；
[0031](3)65℃1.3h，80℃10min，stroe at
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20℃。
[0032]进一步，步骤三中，所述PCR引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。
[0033]进一步，步骤三中，使用Phana酶为Phanta Max Super
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种环状RNA的高效表达方法，其特征在于，所述环状RNA的高效表达方法包括以下步骤：步骤一，克隆环状RNA全长序列至pCRE5载体,命名为pCRE5
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circRNA；步骤二，将pCRE5
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circRNA质粒瞬时转染至目标细胞或包装成慢病毒感染目标细胞，并分别对目标细胞进行RNA抽提和逆转录；步骤三，环化引物设计及检测PCR体系构建。2.如权利要求1所述环状RNA的高效表达方法，其特征在于，步骤一中，所述克隆环状RNA全长序列至pCRE5载体，包括：(1)PCR扩增F
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circSR1全长；(2)使用Vazyme ClonExpressTM II One Step Cloning Kit将获取的片段与PCRE5载体进行重组连接，将F
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circSR1克隆至环状RNA过表达区之间，命名为pCRE5
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F
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circSR1。3.如权利要求2所述环状RNA的高效表达方法，其特征在于，步骤(1)中，所述PCR引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：1；步骤(2)中，使用Phana酶为Phanta Max Super
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Fidelity DNA Polymerase，50μL反应体系，PCR反应条件为：PCR反应条件PCR反应条件4.如权利要求1所述环状RNA的高效表达方法，其特征在于，步骤一中，所述PCR产物回收扩增片段，全长1907bp。5.如权利要求1所述环状RNA的高效表达方法，其特征在于，步骤二中，所述RNA抽提，包括：(1)使用Lipo2000将pCRE5
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F
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circSR1质粒瞬时转染至H1299或A549或其他细胞，24h后收获RNA；(2)提取F
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circSR1过表达细胞RNA：在6...

【专利技术属性】
技术研发人员：巫轲，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：