一种转基因动物生产方法及狂犬病动物模型构建方法技术

本发明专利技术公开了一种转基因动物生产方法及狂犬病动物模型构建方法。将外源G蛋白编码基因插入到实验动物胚胎干细胞中，即可获得外源全身性表达G蛋白的转基因动物。用G蛋白缺陷型街毒对转基因动物进行感染，由转基因动物为缺陷型街毒补充G蛋白，即可获得狂犬病动物模型。转基因动物为缺陷型RV补充G蛋白恢复街毒活性，可极大降低RV街毒获取、扩增和保管的难度；在体内感染的缺陷型RV离开动物体后，没有其他来源的G蛋白补充时没有单独感染与传播的能力，可视作无感染性材料，极大降低了生物安全风险与门槛。转基因动物提供的G蛋白量少于RV街毒表达的G蛋白量，因而动物模型的狂犬病进程相对于自然状态下能够更好控制与观察病程进度。进度。进度。

【技术实现步骤摘要】
一种转基因动物生产方法及狂犬病动物模型构建方法


[0001]本专利技术涉及模型动物研究
，具体涉及一种转基因动物生产方法及狂犬病动物模型构建方法。

技术介绍

[0002]狂犬病(Rabies)是全世界已知最致命的神经性病毒性疾病之一。绝大部分病例的产生与欧洲、亚洲和非洲的狗咬伤以及美洲的蝙蝠咬伤离不开关系。不同亚种的狂犬病毒(Rabies Virus，以下简称为RV)导致的狂犬病表型有所差异，大致分为狂躁型狂犬病与瘫痪型狂犬病，被咬伤后根据RV亚种不同以及伤口大小，发病率也不尽相同，相同的是其发病后接近百分之一百的死亡率，全球每年有数以万计的人因狂犬病死亡。
[0003]RV归类于弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus)。病毒外壳呈弹状，有包膜包裹，核衣壳螺旋对称，内含负义单链RNA，编码5种病毒蛋白，分别为G蛋白(Glycoprotein，糖蛋白，以下简称为G蛋白)，N蛋白(Nucleoprotein，核蛋白)，P蛋白(Phosphoprotein，磷蛋白)，M蛋白(Matrix protein，基质蛋白)和L蛋白(Large protein，大蛋白，本质是RNA导向的RNA聚合酶)。其中G蛋白与RV的感染与传播息息相关，在失去G蛋白的情况下，RV无法形成感染性病毒颗粒，也无法感染与传播，从另一个意义上来说，G蛋白也定义了RV的感染与传播特性。不同亚种的RV携带的G蛋白的序列与特性不尽相同，在神经系统中的感染与传播效率也有所不同。根据RV的致死与否，RV目前的亚株又被分为不致死的疫苗株以及致死的街毒株。相对来说，街毒株G蛋白的感染与传播效率强于疫苗株，以实验室常用的街毒株以及疫苗株来说，作为街毒株的CVS株G蛋白的感染与传播效率就要显著强于作为疫苗株的SAD株G蛋白。
[0004]目前针对狂犬病最有效的治疗方法就是在被携带RV的动物咬伤后注射狂犬疫苗，对狂犬病进行预防性治疗，防止病毒进一步感染。在医疗条件较为先进的地区，处理得当的条件下，狂犬病并不能威胁到人类的生命安全。但如果被携带RV的哺乳动物咬伤后没有及时接种狂犬疫苗，最终导致狂犬病发，因为目前还没有有效的医疗手段可以干预发病后的狂犬病进程，所以能够采取的医疗手段非常有限，只能降低病人痛苦，等待病人死亡。正基于此，对狂犬病致病机制以及发病后治疗方法的研究依旧是非常重要的工作。
[0005]在研究狂犬病发病机制上，鼠是一种非常方便和理想的模型动物。它们繁殖能力强，生殖周期短，发育快，饲养相对简单，经济实惠；同时相比于斑马鱼，果蝇和线虫，鼠是常用的经济型实验动物中与人类亲缘关系最接近的一支，因此在研究疾病方面有着极大的优势；并且鼠遗传信息的操作和修饰都非常成熟，可以制作转基因鼠去表达不同的外源蛋白帮助疾病模型的建立与分析。
[0006]目前针对狂犬病的研究中，小鼠的狂犬病模型一般通过让小鼠人为感染野生RV(Street Virus，以下简称街毒)的模式来建立。一般分为两种途径，一种是脑内直接注射街毒感染，一种是利用街毒悬液对小鼠滴鼻感染。
[0007]现有研究体系存在的问题主要有两点，一是实验室环境的问题。鉴于上述两种方
式都涉及利用街毒，根据《卫生部关于印发<人间传染的病原微生物名录>的通知》的要求，利用RV街毒进行感染性实验，对狂犬病病程进行复刻与研究，必须在ABSL
‑
3(生物安全三级动物实验室，以下简称ABSL
‑
3)中进行。ABSL
‑
3从建筑设计与施工到实验室内人员与环境管理都有着严苛的要求与规定，极大拉高了狂犬病的研究门槛。二是街毒获取与操作难度的问题。街毒是危害程度二级的病原，它的培养需要BSL
‑
3(生物安全三级实验室，以下简称为BSL
‑
3)，BSL
‑
3也对环境和实验室配置有着严苛的要求与规定，这进一步拉高了狂犬病的研究门槛，同时由于街毒对操作人员以及其他相关人员也具备潜在感染威胁，需要防范自身感染以及泄露的问题，所以对操作人员的专业素质也有极高的要求。
[0008]因此，亟待新的狂犬病动物模型构建方式，以降低对狂犬病的研究门槛，提高研究的生物安全性。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的是提供一种用于狂犬病动物模型的转基因动物的生产方法，以及一种狂犬病动物模型的构建方法，安全风险低，对实验室的要求也低，降低了对狂犬病的研究门槛。
[0010]本专利技术技术方案详述如下：
[0011]第一方面，本专利技术提供了一种转基因动物的生产方法，用于狂犬病动物模型的构建，是将外源G蛋白编码基因插入到实验动物胚胎干细胞中，获得外源全身性表达G蛋白的转基因动物。
[0012]可选或优选的，上述构建方法中，在外源G蛋白编码基因上游克隆有LSL表达盒，通过Cre介导实现G蛋白的条件性表达。LSL表达盒即LoxP
‑
Stop
‑
LoxP表达盒，包含3
×
Stop元件，即3个重复的SV40 polyA，序列两端为LoxP位点，设置在外源G蛋白编码基因上游，能够限制外源G蛋白编码基因的表达。Cre重组酶不存在的情况下，该LSL表达盒能够完全阻止外源G蛋白编码基因的正常表达，当将Cre重组酶引入后，外源G蛋白编码基因上游的LSL表达盒将会被删除，使得LSL外源G蛋白编码基因能够在启动子下被激活表达。通过这种条件性表达的限制，可以有效避免全身性表达G蛋白引起动物死亡导致实验失败的情况发生，提高实验成功率。
[0013]可选或优选的，上述构建方法中，所述动物为C57BL/6小鼠，所述通过Cre介导实现G蛋白的条件性表达，具体方式如下：插入有外源G蛋白编码基因的胚胎干细胞发育生长成熟的小鼠，与Cre小鼠交配后获得的子代才是外源全身性表达G蛋白的转基因动物；而未与Cre小鼠交配所获得的子代不会表达G蛋白。
[0014]上述方法中，由于使用含插入有外源G蛋白编码基因的胚胎干细胞通常是采用显微注射方式注射到小鼠囊胚中，发育后获得的F0代小鼠身上只有一部分细胞是由被注射的外源G蛋白编码基因的胚胎干细胞长成的，即F0代小鼠是嵌合鼠。如果该嵌合鼠的生殖系统不是由被注射的外源G蛋白编码基因的胚胎干细胞长成的，则用该F0代小鼠与Cre小鼠进行杂交，后代不会出现携带G蛋白编码基因的小鼠，杂交没有意义。所以为了提高方法的稳定性，获得更稳定的、全身都表达G蛋白的小鼠，优选使用F0代嵌合体小鼠先经过一轮自交或与野生型小鼠杂交，挑选能够全身表达G蛋白的子代即F1代小鼠，用该F1代小鼠与Cre小鼠交配，会更加稳定可靠。此时上述方法中所述的插入有外源G蛋白编码基因的胚胎干细胞发
育生长成熟的小鼠，是指F1代小鼠。
[0015]可选或优选的，上述构建方法中，所述外源G蛋白编码基因插入实验动物胚胎干细胞的Rosa26位点两外显子之间。Rosa26是较为安全的外源基因插入位点，且容易进行同源重组，插本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种转基因动物生产方法，所述转基因动物用于构建狂犬病动物模型，其特征在于，将外源G蛋白编码基因插入到实验动物胚胎干细胞中，获得外源全身性表达G蛋白的转基因动物。2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，在外源G蛋白编码基因上游克隆有LSL表达盒，通过Cre介导实现G蛋白的条件性表达。3.根据权利要求2所述的生产方法，其特征在于，所述动物为C57BL/6小鼠，所述通过Cre介导实现G蛋白的条件性表达，具体方式如下：插入有外源G蛋白编码基因的胚胎干细胞发育生长成熟的小鼠，与Cre小鼠交配后获得的子代才是外源全身性表达G蛋白的转基因动物；而未与Cre小鼠交配所获得的子代不会表达G蛋白。4.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述外源G蛋白编码基因插入实验动物胚胎干细胞的Rosa26位点两外显子之间。5.根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于，所述外源G蛋白编码基因通过打靶载体插入到实验动物胚胎干细胞，获得打靶成功的ES细胞；所述打靶载体的多克隆位点插入了外源G蛋白编码基因。6.根据权利要求5所述的生产方法，其特征在于，所述打靶载体为Rosa26
‑
tdTomato
‑
G
‑
TVA
‑
vector，包括5
’
同源臂、启动子CAG、LSL表达盒、tdTomato序列、G蛋白编码基因序列、IRES序列、TVA序列、WPRE序列、PA序列、FRT序列、Neo抗性基因、3
’
同源臂、pGK启动子、DTA序列、polyA signal、CoLE1质粒复制起点、AmpR抗性基因、F1单链DNA复制起点。7.根据权利要求6所述的生产方法，其特征在于，所述打靶载体添加有酶切位点，包括SalⅠ、SmaⅠ、EcoR
Ⅴ
、XhoⅠ，其中，SalⅠ分别添加在启动子CAG与LSL表达盒之间、tdTomato序列和G蛋白编码基因序列之间、WPRE序列和PA序列之间、Ne...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鑫焱，宋一舸，李浩，张冰，李澜芳，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：