一种调控PCV2在宿主细胞中复制的方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种调控PCV2在宿主中复制的方法及应用。通过METTL14基因、FTO基因和miR30a

【技术实现步骤摘要】
一种调控PCV2在宿主细胞中复制的方法及应用


[0001]本专利技术属于生物技术和兽医药
，具体涉及一种调控PCV2在宿主细胞中复制的方法。

技术介绍

[0002]猪圆环病毒2型(PorcineCircovirustype2，PCV2)是圆环病毒属的一种单股负链DNA病毒，主要侵害猪只的免疫系统，造成免疫抑制，是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原体，给养猪业带来巨大的经济损失。
[0003]N6
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甲基腺苷（m6A）甲基化调控是高等真核生物RNA的转录后水平的调控方式，于1974年首次被发现，近年来引起了人们的极大兴趣。m6A主要富集在mRNA的启动子区、终止密码子区以及RRACH motif内，它广泛的存在于哺乳动物，植物、酵母、果蝇等各类真核生物中。
[0004]m6A这种甲基化修饰被证明是动态和可逆的。甲基化过程是由甲基化转移酶（methyltransferase）METTL3和METTL14 1:1的比例形成的异源二聚体催化，并由亚基蛋白WTAP调控。m6A甲基化可以由烷基化修复同源蛋白5(ALKBH5)和肥胖相关蛋白(FTO)组成的m6A去甲基酶(ERASER)去除。越来越多的证据表明，m6A基因在哺乳动物中具有多种生物学功能，m6A修饰可以影响mRNA代谢过程，包括mRNA的加工、出核运输、翻译和 稳定性，以及在RNA转录后水平调控基因的表达，进而影响各种生理过程，如生长、发育、生殖、细胞多能性、减数分裂、昼夜节律和疾病发生等。
[0005]病毒的生命周期是依赖宿主细胞的相关机制和途径进行的，从表观遗传学角度研究病毒活动过程对促进抗病毒机制的研究具有重要意义。人们最先在腺病毒(Ad)和甲型流感病毒(IAV)的mRNA上检测到m6A。随后，在单纯疱疹病毒1型(HSV
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1)、劳斯氏肉瘤病毒(RSV)、猴空泡病毒40(SV40)、B77肉瘤病毒、禽流感病毒和猫白血病病毒等病毒RNA中也检测到了m6A。这些研究发现证明了m6A甲基化表观遗传修饰在病毒的侵染复制过程中具有重要作用。然而，对PCV2病毒复制中m6A所发挥的作用并没有报道。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中的问题，本专利技术提供一种调控PCV2在宿主中复制的方法，通过调控m6A甲基化修饰对于PCV2复制过程进行影响，从而达到促进或者抑制PCV2在宿主细胞内复制的作用。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。
[0008]METTL14基因在调控PCV2病毒在宿主细胞中复制的应用。
[0009]优选地，所述应用为：a）通过药物使PK
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15细胞中METTL14基因的表达量提高以提高PCV2病毒的复制量或滴度，或，b）通过药物使PK
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15细胞中METTL14基因的表达量降低以降低PCV2病毒的复制量
或滴度。
[0010]FTO基因在调控PCV2病毒在PK
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15细胞中复制的应用。
[0011]优选地，所述应用为：a）通过过表达质粒转染使PK
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15细胞中FTO基因的表达量降低以提高PCV2病毒的复制量或滴度，或，b）通过siRNA沉默使PK
‑
15细胞中FTO基因的表达量提高以降低PCV2病毒的复制量或滴度。
[0012]所述药物的活性成分可以为靶向METTL14基因或FTO基因的小干扰RNA（siRNA）或短发卡RNA（shRNA），包含上述小干扰RNA或短发卡RNA的载体，过表达METTL14基因或FTO基因的载体。
[0013]miR
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30a
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5p在调控PCV2病毒在宿主细胞中复制的应用。
[0014]优选地，所述应用为：a）通过药物使PK
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15细胞中miR
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30a
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5p的表达量提高以提高PCV2病毒的复制量或滴度，或，b）通过药物使PK
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15细胞中miR
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30a
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5p的表达量降低以降低PCV2病毒的复制量或滴度。
[0015]所述药物的活性成分可以为靶向miR
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30a
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5p的mimic或inhibitor。
[0016]本专利技术具有以下优点：本专利技术通过研究PCV2侵染和未侵染PK
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15细胞中m6A修饰、甲基化相关酶和miRNA含量上的差异，发现侵染病毒后导致机体的甲基化水平上调，且甲基化转移酶METTL14、去甲基化转移酶FTO、miR
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30a
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5p在两种PK
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15细胞中存在显著的差异。通过构建METTL14和FTO过表达和沉默细胞、转染miR
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30a
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5p mimics细胞发现，METTL14是能够引起m6A甲基化水平升高的关键调控基因，同时FTO能够使甲基化总体水平呈现降低趋势；miR
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30a
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5p受到METTL14和FTO介导的m6A修饰调控，m6A修饰能够促进成熟miR
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30a
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5p的产生。将miR
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30a
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5p mimics转染进PK
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15细胞后并接种PCV2病毒液后发现，miR
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30a
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5p可以促进PCV2病毒的复制，并发现可以通过mimics在METTL14缺失和FTO过表达形成的m6A水平低的细胞中对PCV2复制形成补救。这说明通过m6A水平低造成的miRNA表达量低可以通过补救来实现。本专利技术为利用宿主蛋白提高自身免疫力抵抗病毒感染，寻找病毒通用治疗靶点提供重要的依据。
附图说明
[0017]图1是PCV2感染对PK
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15细胞中的RNA甲基化表达水平的影响；图2是PCV2感染对PK
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15细胞中miRNA表达水平的影响；图3是转录组测序结果中各甲基化酶表达趋势；图4是RT
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qPCR检测侵染PCV2病毒和未侵染的PK
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15细胞中m6A调控相关基因表达量的差别；图5是靶向METTL14 siRNA沉默效果验证（a. qPCR和b. Western Blot）；图6是靶向FTO siRNA沉默效果验证（a. qPCR和b. Western Blot）；图7是METTL14过表达转染效果验证（a. qPCR和b. Western Blot）；
图8是FTO过表达转染效果验证（a.qPCR和b.WesternBlot）；图9是METTL14和FTO沉默表达与过表达对细胞中m6A甲基化水平的影响；图10是METTL14和FTO沉默表达与过表达对PCV2复制的影响；图11是METTL14沉默表达与过本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.METTL14基因、FTO基因和miR
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30a
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5p在调控PCV2病毒在宿主细胞中复制的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为：a）通过药物使PK
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15细胞中METTL14基因的表达量提高以提高PCV2病毒的复制量或滴度，或，b）通过药物使PK
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15细胞中METTL14基因的表达量降低以降低PCV2病毒的复制量或滴度。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为：a）通过过表达质粒转染使PK
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15细胞中FTO基因的表达量降低以提高PCV2病毒的复制量或滴度，或，b）通过siRNA沉默使PK
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15细胞中FTO基因的表达量提高以降低PCV2病毒的复制量或滴度。4.根据权利要求1所述的应用，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：李俊，时建立，彭喆，杨莹，李琛，刘畅，徐绍建，田瑶，李佳昕，吴晓燕，王硕，韩红，
申请(专利权)人：山东省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：