永生化猪骨髓巨噬细胞、其构建方法及应用技术

本申请公开了一种永生化猪骨髓巨噬细胞、其构建方法及应用。所述构建方法包括：以包含SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一重组质粒转染猪骨髓巨噬细胞，再培养转染后的细胞，并分离出细胞单克隆。进而，本申请还通过以包含SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二重组质粒、第三重组质粒转染永生化猪骨髓巨噬细胞的方式对其进行了改造。本申请提供的永生化猪骨髓巨噬细胞系的构建及改造方法均简单易操作，所获永生化猪骨髓巨噬细胞系具有可以持续传代的显著特点，其经改造后对病毒的敏感性高。高。高。

【技术实现步骤摘要】
永生化猪骨髓巨噬细胞、其构建方法及应用


[0001]本申请具体涉及一种永生化猪骨髓巨噬细胞、其构建方法及应用，属于生物


技术介绍

[0002]巨噬细胞是机体重要的免疫防御细胞之一，广泛分布于全身，存在于淋巴器官、肝脏、肺、胃肠道、中枢神经系统、骨骼和皮肤中，是宿主天然免疫和特异性免疫的重要组成部分，也是免疫反应中的关键调节及效应细胞(Verdeguer F and Aouadi M.Macrophage heterogeneity and energy metabolism[J].ExpCellRes，2017，360(1)：35
‑
40)。巨噬细胞在非特异性免疫中，可通过吞噬作用杀灭及清除病原体和异物介导炎症反应，参与先天性免疫应答；以及，在特异性免疫中，作为抗原递呈细胞加工和递呈抗原并启动获得性免疫应答，同时可分泌细胞因子发挥免疫调节作用(MurrayP J.Immune regulation by monocytes[J].Semin Immunol，2018，35：12
‑
18)。不同分化状态下的巨噬细胞对病毒的易感性不同，病毒可通过感染巨噬细胞阻止巨噬细胞的吞噬作用、抑制其抗原呈递能力、减少调节促炎症细胞因子的产生，影响宿主的获得性免疫应答。因此研究巨噬细胞对今后病毒的研究至关重要。
[0003]巨噬细胞的极化是微环境信号刺激从而获得不同表型和功能特征的过程，普遍采用体外经GM
‑
CSF培养骨髓单核细胞的方法获得，一般包括两种途径，分别是经典活化途径和选择性活化途径。经典活化的M1型巨噬细胞由IFN
‑
α及脂多糖(LPS)刺激而来，其特征是分泌Th1相关细胞因子IL
‑
12、IL
‑
6、IL
‑
1、TNF
‑
α，参与机体炎症反应，呈现出较强的抗原递呈及吞噬能力。选择性活化的M2型巨噬细胞的特征是分泌Th2相关因子IL
‑
10等，可减轻局部炎性反应，促进组织修复能力(Garcia
‑
Nicolas O，BaumannA，VielleNJ，et al.Virulence and genotype
‑
associated infectivity ofinterferon
‑
treated macrophages by porcine reproductive and respiratory syndrome viruses[J].Virus Res，2014，179：204
‑
11)。根据刺激因子的不同，可以进一步将M2型巨噬细胞分化为M2a(IL
‑
4和IL
‑
13诱导)、M2b(通过免疫复合物和TLR或IL
‑
1R激动剂诱导)以及M2c巨噬细胞(由IL
‑
10诱导)。
[0004]巨噬细胞是许多猪源性病毒靶向的主要细胞，而骨髓来源的巨噬细胞在机体内分布广泛且可塑性强，还具有产量高、易转染、生长周期长等优点，因此具有更高的潜在研究意义。目前生命科学研究常涉及两类细胞，一类为原代细胞，另一类为永生化细胞或细胞系，目前猪骨髓巨噬细胞在体外培养时均存在生长条件要求严格、存活时间及产量有限、难以传代等问题，因此需要采用永生化技术建立永生化的猪骨髓巨噬细胞系，但迄今鲜见相关报道。

技术实现思路

[0005]本申请的主要目的在于提供一种永生化猪骨髓巨噬细胞、其构建方法及应用，以
克服现有技术中的不足。
[0006]为实现前述专利技术目的，本申请采用的技术方案包括：
[0007]本申请的一个方面提供了一种永生化猪骨髓巨噬细胞的构建方法，其包括：以包含SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或其增加或截短的序列的第一重组质粒转染猪骨髓巨噬细胞，再培养转染后的细胞，并分离出细胞单克隆。
[0008]在一些实施方式中，所述第一重组质粒的构建方法包括：
[0009]通过PCR将BglII和BCLI位点加入SV40TAg的核苷酸序列中，获得重组SV40TAg基因；
[0010]使用BglII和BCLI位点将重组SV40TAg基因克隆入pIED
‑
Neo质粒，从而生成所述第一重组质粒，定义为pIED
‑
Neo
‑
SV40TAg质粒。
[0011]在一些实施方式中，所述的永生化猪骨髓巨噬细胞的构建方法具体包括：
[0012]选取15日龄健康仔猪的腿骨，使用完全培养基冲洗骨髓腔，获得骨髓细胞，
[0013]将所述骨髓细胞以GM
‑
CSF诱导培养液诱导分化成为猪骨髓巨噬细胞。
[0014]进一步的，所述完全培养基含有10V/V％的胎牛血清。
[0015]进一步的，所述GM
‑
CSF诱导培养液包含1wt％primocin抗生素、10wt％FBS和100ng/mLGM
‑
CSF，余量为1640培养基。
[0016]在一些实施方式中，所述的永生化猪骨髓巨噬细胞的构建方法还包括：将所述猪骨髓巨噬细胞以完全培养基重悬，35～38℃培养50～80min，取培养后未贴壁的细胞转入新的完全培养基中培养，从而实现所述猪骨髓巨噬细胞的扩增。
[0017]在一些实施例中，所述的永生化猪骨髓巨噬细胞的构建方法具体包括如下步骤：
[0018](1)选取15日龄健康仔猪，取腿骨，使用完全培养基冲洗骨髓腔，获得骨髓细胞；
[0019](2)将所述骨髓细胞分装入多孔板(例如，6孔板、24孔板)中，以GM
‑
CSF诱导培养液培养并诱导分化成为猪骨髓巨噬细胞；
[0020](3)更换多孔板中的培养上清，用pIED
‑
Neo
‑
SV40TAg质粒进行转染；
[0021](4)将转染后的猪骨髓巨噬细胞静置培养，部分细胞形成细胞群落，分离细胞单克隆，得到永生化猪骨髓巨噬细胞系。
[0022]进一步的，在步骤(4)中，所述猪骨髓巨噬细胞的接种量为0.5
×
105～2
×
105个/孔。
[0023]进一步的，在步骤(4)中，所述完全培养基的添加量为0.8～2ml/孔。
[0024]进一步的，步骤(4)还包括：采用0.5～5μg/ml嘌呤霉素处理经转染后的猪骨髓巨噬细胞系，处理1～4天后，筛选出其中的阳性细胞克隆，并挑选单克隆细胞株，获得永生化猪骨髓巨噬细胞系。
[0025]本申请的另一个方面提供了一种永生化猪骨髓巨噬细胞，它是由本申请所述的任一种方法构建。
[0026]本申请的另一个方面提供了一种永生化猪骨髓巨噬细胞的改造方法，其包括：以包含SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二重组质粒和/或包含SEQ ID NO本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种永生化猪骨髓巨噬细胞的构建方法，其特征在于，包括：以包含SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一重组质粒转染猪骨髓巨噬细胞，再培养转染后的细胞，并分离出细胞单克隆。2.根据权利要求1所述的永生化猪骨髓巨噬细胞的构建方法，其特征在于，所述第一重组质粒的构建方法包括：通过PCR将BglII和BCLI位点加入SV40TAg的核苷酸序列中，获得重组SV40TAg基因；使用BglII和BCLI位点将重组SV40TAg基因克隆入pIED
‑
Neo质粒，从而生成所述第一重组质粒，定义为pIED
‑
Neo
‑
SV40TAg质粒。3.根据权利要求1所述的永生化猪骨髓巨噬细胞的构建方法，其特征在于，具体包括：选取15日龄健康仔猪的腿骨，使用完全培养基冲洗骨髓腔，获得骨髓细胞，将所述骨髓细胞以GM
‑
CSF诱导培养液诱导分化成为猪骨髓巨噬细胞；其中，所述完全培养基含有10V/V％的胎牛血清；所述GM
‑
CSF诱导培养液包含1wt％primocin抗生素、10wt％FBS和100ng/mLGM
‑
CSF，余量为1640培养基。4.根据权利要求3所述的永生化猪骨髓巨噬细胞的构建方法，其特征在于，还包括：将所述猪骨髓巨噬细胞以完全培养基重悬，35～38℃培养50～80min，取培养后未贴壁的细胞转入新的完全培养基中培养，从而实现所述猪骨髓巨噬细胞的扩增。5.一种永生化猪骨髓巨噬细胞，其特征在于，它是由权利要求1
‑
4中任一项所述的方法构建。6.一种永生化猪骨髓巨噬细胞的改造方法，其特征在于，包括：以包含SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二重组质粒和/或包含SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第三重组质粒转染权利要求5所述的永生化猪骨髓巨噬细胞，并筛选出其中的阳性细胞株，获得对病毒敏感的永生化猪骨髓巨噬细胞。7.根据权利要求6所述的永生化猪骨髓巨噬细胞的改造方法，其特征在于，具体包括：(1)以所述第二...

【专利技术属性】
技术研发人员：张大鹤，滕小锘，王俊肖，徐龙飞，
申请(专利权)人：苏州沃美生物有限公司，
类型：发明
国别省市：