一种在鲤EPC细胞中高效瞬时转染质粒的方法技术

本发明专利技术公开了用于鲤EPC细胞转染的乳白蛋白载体，乳白蛋白载体为表面修饰有马来酰亚胺的α

【技术实现步骤摘要】
一种在鲤EPC细胞中高效瞬时转染质粒的方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，涉及一种用于细胞转染的乳白蛋白载体，还涉及一种用于细胞转染的乳白蛋白载体的制备方法，还涉及一种在鲤EPC细胞中高效瞬时转染质粒的方法，还涉及乳白蛋白载体的用途。

技术介绍

[0002]鲤鱼上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprini,EPC)起源于鲤鱼表皮疱疹病毒感染引起的病变组织，目前已经衍生出80多株细胞系。其生长适应温度范围较广(15℃
‑
33℃)，且能在7℃
‑
10℃的环境种存活数月。EPC细胞的生长特性使其成为研究鲤基因功能、细胞增殖、分化、凋亡的理想材料，也是其他淡水鱼类基因功能研究的重要材料。
[0003]细胞转染是研究和控制真核细胞基因功能的常规实验，在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，其应用越来越广泛。转染是将外源DNA片段导入真核细胞以获得新的生物学特性的方式，大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。(1)物理介导是通过物理方法将基因导入细胞，如电穿孔法和显微注射；(2)化学介导方法应用最广泛，如磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；(3)生物介导方法，有应用较早的原生质体转染，和现在比较多见的病毒介导的转染技术。
[0004]相比物理介导和生物介导方式，基于脂质体的转染方法因其优点，而应用最广泛。(1)物理介导转染方法需要专用设备，而脂质体的转染方法无需专用设备、操作简便、细胞致死率低；(2)病毒介导转染方法要求逆转录病毒的繁殖必须要有适当的包装细胞系，以利于产生高滴度的病毒，同时还具有适当的结构。病毒介导转染方法还需要构建载体、包装提纯病毒等步骤，因此周期长、步骤繁杂、成本高。而脂质体的转染方法无需上述步骤。
[0005]尽管鱼类细胞的生长模式和培养条件与哺乳动物细胞存在较大差异，但是考虑到脂质体转染方法的简便性，仍然应用脂质体转染方法于鱼类细胞上。但基于脂质体转染方法在鱼类中的应用仍然面临如下缺陷：(1)脂质体转染需要无血清环境以提高其转染效率，但无血清环境对鱼类细胞的毒性很高，容易造成细胞存活率低；(2)鱼类细胞培养环境温度较低，代谢较慢，脂质体转染效率较哺乳动物细胞要低。鉴于鱼类细胞在基因功能研究和经济性状遗传解析的重要性以及基于脂质体转染方法在鱼类中的应用所面临的问题，有必要专利技术一种简便高效转染鱼类细胞的方法，为鱼类基因功能研究提供更有力的工具。

技术实现思路

[0006]本专利技术的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
[0007]本专利技术还有一个目的是提供用于细胞转染的乳白蛋白载体。
[0008]本专利技术另有一个目的是提供一种用于细胞转染的乳白蛋白载体的制备方法。
[0009]本专利技术再有一个目的是提供一种在鲤EPC细胞中高效瞬时转染质粒的方法。
[0010]本专利技术还有一个目的是提供所述的乳白蛋白载体或依照所述的方法制备得到的乳白蛋白载体于遗传物质转染、制备转染用试剂盒和科学研究中的用途。
[0011]为此，本专利技术提供的技术方案为：
[0012]用于细胞转染的乳白蛋白载体，所述乳白蛋白载体为表面修饰有马来酰亚胺的α
‑
乳白蛋白球型颗粒。
[0013]优选的是，所述的用于细胞转染的乳白蛋白载体中，所述乳白蛋白载体具有正电势。
[0014]用于细胞转染的乳白蛋白载体的制备方法，包括如下步骤：
[0015]1.1)将α
‑
乳白蛋白通过酶解后以超声重聚的方法使其成为球型颗粒；
[0016]1.2)连接马来酰亚胺至球型的α
‑
乳白蛋白颗粒中使其形成乳白蛋白载体。
[0017]优选的是，所述的用于细胞转染的乳白蛋白载体的制备方法中，步骤1.1)中，将α
‑
乳白蛋白粉末溶解于PBS溶液中，加入地衣芽孢杆菌水解酶进行酶解，之后超声震荡约45s。
[0018]优选的是，所述的用于细胞转染的乳白蛋白载体的制备方法中，在所述步骤1.1)之后还包括如下步骤：
[0019]1.3)向经过超声震荡的蛋白中加入1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，活化蛋白表面羧基基团；
[0020]之后进入步骤1.2)。
[0021]在鲤EPC细胞中高效瞬时转染质粒的方法，包括如下步骤：
[0022]2.1)培养鲤鱼EPC细胞用于转染；
[0023]2.2)将乳白蛋白载体和和待转染质粒混合，之后将吸附待转染质粒的乳白蛋白载体加入到EPC细胞培养基，形成转染培养基，所述乳白蛋白载体采用所述的乳白蛋白载体或如所述的方法制备得到的乳白蛋白载体；
[0024]2.3)利用转染培养基培养鲤鱼EPC细胞一段时间后，移除转染培养基，并更换回EPC细胞培养基对转染后的鲤鱼EPC细胞继续培养。
[0025]优选的是，所述的在鲤EPC细胞中高效瞬时转染质粒的方法中，步骤2.2)中，所述乳白蛋白载体和待转染质粒的质量比1000:1；所述待转染质粒在所述转染培养基中的终浓度为125ng/μL。
[0026]优选的是，所述的在鲤EPC细胞中高效瞬时转染质粒的方法中，步骤2.3)中，所述一段时间为12小时以上。
[0027]所述的乳白蛋白载体或依照所述的方法制备得到的乳白蛋白载体于遗传物质转染、制备转染用试剂盒科学研究中的用途。
[0028]本专利技术至少包括以下有益效果：
[0029]本专利技术的方法利用乳白蛋白为载体，通过吸附质粒并将其递送到EPC细胞中并表达。本专利技术的方法对细胞毒性低、操作简便、转染效率高于脂质体转染方法，可做为鱼类细胞的通用基因导入方法，具有良好的应用前景。
[0030]本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
[0031]图1为本专利技术其中一个实施例中转染后96h流式细胞仪对GFP阳性细胞的分析图，其中，A.筛选Lipofectamine 2000转染的GFP阳性细胞；B.筛选Fugene转染的GFP阳性细胞；C.筛选本专利技术转染的GFP阳性细胞。
[0032]图2为本专利技术其中一个实施例中转染后96h荧光显微镜观察GFP阳性细胞照片，其中，第一列为明场拍摄的EPC细胞；第二列为荧光显微镜488nm激发光下观察到的GFP阳性细胞；第三列为前两列重叠后显示出的GFP阳性细胞。
[0033]图3为本专利技术其中一个实施例中转染后24、48、72h荧光显微镜观察GFP阳性细胞照片，其中，第一列为明场拍摄的EPC细胞；第二列为荧光显微镜488nm激发光下观察到的GFP阳性细胞；第三列为前两列重叠后显示出的GFP阳性细胞。
具体实施方式
[0034]下面结合实施例和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于细胞转染的乳白蛋白载体，其特征在于，所述乳白蛋白载体为表面修饰有马来酰亚胺的α
‑
乳白蛋白球型颗粒。2.如权利要求1所述的用于细胞转染的乳白蛋白载体，其特征在于，所述乳白蛋白载体具有正电势。3.用于细胞转染的乳白蛋白载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1.1)将α
‑
乳白蛋白通过酶解后以超声重聚的方法使其成为球型颗粒；1.2)连接马来酰亚胺至球型的α
‑
乳白蛋白颗粒中使其形成乳白蛋白载体。4.如权利要求3所述的用于细胞转染的乳白蛋白载体的制备方法，其特征在于，步骤1.1)中，将α
‑
乳白蛋白粉末溶解于PBS溶液中，加入地衣芽孢杆菌水解酶进行酶解，之后超声震荡约45s。5.如权利要求3所述的用于细胞转染的乳白蛋白载体的制备方法，其特征在于，在所述步骤1.1)之后还包括如下步骤：1.3)向经过超声震荡的蛋白中加入1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵然，李炯棠，张研，王琦，李尚琪，孙晓晴，黄杨美迪，崔明姝，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院，
类型：发明
国别省市：