一种用于早期宫颈癌检测的组合物及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于早期宫颈癌检测的组合物及试剂盒，该组合物包括EPB41L3基因中3个发生高度甲基化的CpG岛区域和JAM3基因中3个发生高度甲基化的CpG岛区域的扩增引物，能覆盖98％以上不同型别宫颈癌，可以实现一管反应检测多基因多甲基化区域的检测。优选配合特定的MGB探针和简并封闭引物，进一步提高了灵敏度和精准性。整个检测过程无创伤、操作简便、易于判读，通用的qPCR设备即可满足检测，PCR过程采用全封闭形式，避免了交叉污染的可能，同时对两个标志物的三个区段进行检测，结果更加精准，综上因素使该发明专利技术具有社会推广性。该检测的高灵敏性适用于无创宫颈癌早期筛查。

A composition and kit for the detection of early cervical cancer

【技术实现步骤摘要】
一种用于早期宫颈癌检测的组合物及试剂盒
本专利技术涉及核酸体外诊断领域，尤其是一种用于早期宫颈癌检测的组合物，通过检测特定的基因甲基化对宫颈癌进行早期筛查及其辅助诊断。
技术介绍
宫颈癌是世界女性第四大易发癌种，2018年约567,600新增病例，同时也是第四位的致死癌种，2018年约有315,000死亡病例。在中国，宫颈癌是目前第五大女性易发癌种，2018年有106,430新增病例，同时在15-44岁女性中是第三大致死癌种。人乳头瘤病毒(HPV，全称为humanpapillomavirus)是绝大多数宫颈癌发生的元凶，在大约95％的恶性宫颈病变中能鉴别出HPV的基因组DNA。人一生中累积的HPV感染风险高达80％，但大多数的HPV感染只是暂时的，可以通过人体自身的免疫调节被自发地清除掉。小于10％的人群出现HPV超过两年的持续性感染，这种持续性感染通常与高危型HPV病毒有关。15种主要高危型HPV病毒包括HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，73，以及82。高危型HPV病毒被认为与宫颈上皮内瘤病变(CIN，全称为cervicalintraepithelialneoplasia)相关，并最终导致宫颈癌的形成。在15种高危型HPV病毒中，HPV-16是最致癌的种类，是一半宫颈癌发生的主要原因。HPV-18，在许多子宫颈内腺癌中被提及，是第二大致癌类型，在所有的宫颈癌中约占了15％的比例。HPV-31和HPV-33是另外两种常见的类型，约占了8％。目前，接种宫颈癌疫苗是预防HPV病毒的主要手段。HPV疫苗包括2价疫苗(HPV-16和HPV-18)，4价疫苗(HPV-16，HPV-11，HPV-16，以及HPV-18)，以及9价疫苗(HPV-6，HPV-11，HPV-16，HPV-18，HPV-31，HPV-33，HPV-45，HPV-52，以及HPV-58)。接种HPV疫苗可以预防大于95％的HPV病毒感染，但疫苗的价格较高，且受年龄和区域的限制，同时所有商业疫苗都是预防性的，对已经感染的群体无治疗效果。早期检测是预防宫颈癌的一种有效方法，目前主要的检测手段包括细胞学和HPV检测。细胞学包含传统巴氏涂片法和液基细胞学检查。HPV检测包含HC2检测，CervisterHRHPV检测，Cobas4800系统检测，以及APtimaHPVmRNA检测等。传统的巴氏涂片法检测费用较低，可重复性高，但是制片方法缺陷造成了漏诊或误诊情况较多，且低准确性，低灵敏度，医生阅片量大，主观性较强，易造成误诊。液基细胞学检查在制片方法上较传统涂片法更进步，但仍然需要依靠医生的经验进行结果判定，在灵敏度和特异性上并不会更优于传统涂片法，仍然具有假阴性高的特点。文献报道，细胞学的检测灵敏度大概为30～87％(受医生的经验影响，受取样的影响，受制片的影响等)，特异性为61～94％，与组织学诊断的匹配度大概为50％，另一方面假阴性的概率甚至高达50％。而HPV分型检测，是基于对宫颈分泌物的HPVDNA进行鉴别，对高级别的CIN有较高的检测灵敏度，文献报道，HPV检测的灵敏度大概在90％。同时，HPV检测是一个相对简单的过程，对中国这样的人口大国而言，在大规模的检测中具有一定的优势。但由于仅有持续性的HPV感染才和癌前病变密切联系，尽管具有较高的灵敏度，HPV检测也无法区分是否阳性的结果跟临床上的病变相关联，甚至可能导致对小的细胞异常过度诊断，造成女性不必要的焦虑，这便降低了HPV检测的特异性，文献报道，HPV的特异性大概为60.7％。目前，在30岁女性中，对高危型HPV种类的检测通常跟细胞学检验共同进行来鉴别高级别病变和宫颈癌。但HPV检测和细胞学的联合检测，仅能增加细胞学的灵敏度，却不能增加HPV检测的特异性，因而，需要一种客观、可重复、特异性高的检测方法来更好得协同HPV检测来分辨出可能形成高级别病变的感染。DNA甲基化作为表观遗传学中的一种，被认为是人类疾病研究最有用的表观标志。有文献表明，从20世纪80年代起，人类基因组中DNA甲基化的过低或过高，几乎和绝大多数甚至是整个的肿瘤相关联。另外，文献表述，从疑似宫颈癌或乳腺癌但病理阴性的女性活检样本中，在很多年后确诊为癌的女性中，DNA甲基化显著高于最终未患癌的女性。2016年，YanTian等人在312位高危型HPV阳性的女性中，提取了基因组DNA对某些基因的甲基化情况以及HPV分型的情况进行的实验。结果显示，HPV16/18和甲基化的联合诊断能达到接近100％的宫颈癌阳性鉴别率。而对于非16/18的其他HPV高危型别，越来越多的文献表明，甲基化可能替代细胞学检测协同HPV检测。综上所述，DNA甲基化联合HPV检测，具有很高的特异性以及灵敏度，更好地弥补HPV检测特异性的不足，可作为HPV检测判定的分流，以更精准地确定相应患者是否具有宫颈恶性病变甚至患有宫颈癌。DNA异常甲基化是人类肿瘤常见的改变。发生在启动子区以及基因内部的CpG岛异常甲基化是基因失活的最常见机制。目前DNA甲基化检测方法有：甲基化特异性的PCR(Methylation-specificPCR，MSP)、亚硫酸氢盐测序法(BisulfitesequencingPCR，BSP)、高分辨率熔解曲线法(HighResolutionMelting，HRM)和高通量测序方法等。相对于其他的检测方法而言，亚硫酸氢盐测序法(BisulfitesequencingPCR，BSP)是DNA甲基化检测中的“金标准”，检测较为精准，但其检测灵敏度相对较低，且操作较繁琐、成本高。高分辨率熔解曲线法(HighResolutionMelting，HRM)在PCR扩增中通过观察熔解曲线的变化来判断DNA是否发生甲基化，此类方法结果分析相对复杂，检测灵敏度相对较低。高通量测序检测方法首先对所检测样本的质量要求很高(基因组总量情况，DNA片段化情况)，检测位点数量多但数据分析的难度相对较大，检测成本高(检测试剂、二代测序仪等)，耗时长(5-7个工作日)，对于临床推广相对困难。甲基化特异性的PCR(Methylation-specificPCR，MSP)检测方法首先对样本质量的要求相对较低(基因组总量可以做到10ng；由于PCR扩增片段在150bp以下，受DNA片段化影响小)，检测成本低(普通的荧光定量PCR即可)、耗时较短(一个工作日即可出结果)，结果易于分析(不涉及大量数据的处理)，是较为常用的DNA甲基化检测方法。临床检测时，宫颈脱落细胞是较为容易获取的组织细胞，在患者采集细胞学或者HPV检测标本时，即可同时进行甲基化的研究，无需额外取样。在宫颈脱落细胞中，正常脱落细胞的背景较高，造成了肿瘤细胞的含量相对较少，如何在高背景下精准地捕捉到甲基化的肿瘤DNA，是甲基化检测的关键也是难点。同时因为重亚硫酸盐转化的损失过高，使得模板DNA含量进一步降低，因此，如何将基因的甲基化高灵敏度、高准确度地检测出来相对较难。因而，对于此类检测试剂的开发需要具备两个方面的要求：高特异性以及高灵敏度。发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于早期宫颈癌检测的组合物，其特征在于，包括针对EPB41L3基因的3对甲基化特异性引物和JAM3基因的3对甲基化特异性引物及1对内参基因引物，其核苷酸序列如下：/nEPB41L3基因1正向引物F：GGAGGACGTTATTTTTTTTCGCTC，/nEPB41L3基因1反向引物R：AACTAACGCGCGCTAACAAAAAC；/nEPB41L3基因2正向引物F：TGGCGCGTTTTGTTTAGAAGTC，/nEPB41L3基因2反向引物R：CCTCCCGCAACACCAACCAAAC；/nEPB41L3基因3正向引物F：TACGTTTGTAATTTTAGTATTTTGG，/nEPB41L3基因3反向引物R：TTCACCGTTTTAACCGAAATAATCTCG；/nJAM3基因1正向引物F：GGATTTTTTTCGGGCGGTGG，/nJAM3基因1反向引物R：ACACAACACTACTACGCAAAATCT,/nJAM3基因2正向引物F：CGTTTCGGTTTTTTAAAGTGTTGA，/nJAM3基因2反向引物R：TATCACTCAATAAAAAACTACACTC；/nJAM3基因3正向引物F：GTTGTTTTAGTCGTTTTCGGAC，/nJAM3基因3反向引物R：CGAAAACTACTTTTAACTACCCGT。/n内参基因(β-actin)正向引物F：GTGATGGAGGAGGTTTAG，/n内参基因(β-actin)反向引物R：AAATTACAAAAACCACAA。/n...

【技术特征摘要】
1.一种用于早期宫颈癌检测的组合物，其特征在于，包括针对EPB41L3基因的3对甲基化特异性引物和JAM3基因的3对甲基化特异性引物及1对内参基因引物，其核苷酸序列如下：
EPB41L3基因1正向引物F：GGAGGACGTTATTTTTTTTCGCTC，
EPB41L3基因1反向引物R：AACTAACGCGCGCTAACAAAAAC；
EPB41L3基因2正向引物F：TGGCGCGTTTTGTTTAGAAGTC，
EPB41L3基因2反向引物R：CCTCCCGCAACACCAACCAAAC；
EPB41L3基因3正向引物F：TACGTTTGTAATTTTAGTATTTTGG，
EPB41L3基因3反向引物R：TTCACCGTTTTAACCGAAATAATCTCG；
JAM3基因1正向引物F：GGATTTTTTTCGGGCGGTGG，
JAM3基因1反向引物R：ACACAACACTACTACGCAAAATCT,
JAM3基因2正向引物F：CGTTTCGGTTTTTTAAAGTGTTGA，
JAM3基因2反向引物R：TATCACTCAATAAAAAACTACACTC；
JAM3基因3正向引物F：GTTGTTTTAGTCGTTTTCGGAC，
JAM3基因3反向引物R：CGAAAACTACTTTTAACTACCCGT。
内参基因(β-actin)正向引物F：GTGATGGAGGAGGTTTAG，
内参基因(β-actin)反向引物R：AAATTACAAAAACCACAA。


2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，还包括不同基因对应的带荧光标记的探针序列：
EPB41L3基因1探针：
FAM-TTTCGCGTCGGTCGTTTAGTTTATTTCGAG-BHQ1；
EPB41L3基因2探针：
FAM-TGGCGGGGAAGCGCGGCGCG-BHQ1；
EPB41L3基因3探针：
FAM-AGGTCGAGGCGGGCGGATCGCGAGGT-BHQ1；
JAM3基因1探针：
CY5-AGCGCGGTAGTTGCGGCGTGGGCGTTG-BHQ2；
JAM3基因2探针：
CY5-AT...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘沛，王林海，
申请(专利权)人：北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11