一种用于预测免疫检测点调节类药物疗效的RT-PCR试剂盒及其预测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于预测免疫检测点调节类药物疗效的RT‑PCR试剂盒及其预测方法。该试剂盒包括用于进行RT‑PCR扩增的引物及其辅助成分；所述引物包括首轮RT‑PCR扩增引物，以及对首轮扩增产物TCR区域进行第二轮扩增的特异性引物；首轮RT‑PCR扩增引物如SEQ ID NO.1～40所示；第二轮扩增引物如SEQ ID NO.41～50所示。本发明专利技术基于高通量测序技术和目标区域特异性扩增技术，从受试者外周血分离淋巴细胞，提取RNA，逆转录获得cDNA，利用特异性引物扩增TCR可变区域，获得其序列信息，评估其多样性。实现了使用很少量外周血样本，在基因分子水平，对免疫检测点调节类药物疗效的预测评估。

A RT-PCR kit for predicting the efficacy of immunomodulators and its prediction method

【技术实现步骤摘要】
一种用于预测免疫检测点调节类药物疗效的RT-PCR试剂盒及其预测方法
本专利技术属于免疫检测
，具体涉及一种用于预测免疫检测点调节类药物疗效的RT-PCR试剂盒及其预测方法。
技术介绍
免疫系统的一个重要功能是分辨自体正常细胞和外来/异常的细胞，从而在保留正常细胞的同时攻击外来/异常细胞。为了避免误伤，人体的T细胞在被激活的同时会表达某些有“免疫检测点”功能的蛋白，例如PD1、CTLA4。如果某个细胞的表面有与之匹配的蛋白，则能够解除T细胞对该细胞的攻击性，例如PD-L1/PD-L2结合PD-1、CD80/CD86结合CTLA-4。某些癌细胞可以表达这样的匹配信号蛋白，从而避免被免疫系统攻击。免疫检测点调节类药物，通过阻断检测到的癌细胞表面和其配型蛋白的结合，从而解除癌细胞的免疫逃逸。目前已有多种免疫检测点调节类药物上市，如靶向PD-1的派姆单抗PembrolizμMab(Keytruda)、纳武单抗NivolμMab，靶向PD-L1的阿特朱单抗AtezolizμMab(Tecentriq)、AvelμMab(Bavencio)、DurvalμMab(Imfinzi)，以及靶向CTLA-4的药物伊匹单抗IpilimμMab(Yervoy)。为了预测免疫检测点调节类药物对肿瘤的疗效，目前已有的方法有(以PD-1为例)：1、取得肿瘤组织切片，使用免疫组化方法检测癌细胞表面PD-L1的表达量。这种方法的缺陷是：1)取得肿瘤组织必须进行穿刺或者做微创手术，部分病人不愿意配合，也会增大肿瘤扩散风险；2)无法预测患者免疫系统对药物的反应，因此即使癌细胞表达PD-L1，免疫检测点调节类药物也只对约20％患者有效，预测准确度不高。2、取得肿瘤组织切片，使用免疫组化方法检测DNA错配修复缺陷(dMMR)，或用基因检测法检测微卫星不稳定性(MSI)或肿瘤突变负荷(TMB)。这种方法的缺陷是：1)必须进行穿刺或者做微创手术；2)无法预测患者免疫系统对肿瘤突变是否产生反应，因此即使dMMR、MSI或TMB检测值较高，免疫检测点调节类药物也只对少数患者有效，预测准确度不高。3、取得肿瘤组织切片，使用免疫组化方法检测肿瘤组织中浸润的淋巴细胞的数量和类型。这种方法的缺陷是：1)必须进行穿刺或者做微创手术；2)无法预测患者免疫系统对肿瘤的反应程度，因此即使检出较高数量肿瘤浸润淋巴细胞且检出PD-1表达，免疫检测点调节类药物也只对少数患者有效，预测准确度不高。4、采集患者血液进行基因检测，检测循环肿瘤DNA(ctDAN)和循环肿瘤细胞(CTC)。这种方法的缺陷是：无法预测患者免疫系统对肿瘤的反应程度，ctDNA和CTC更多只是反映了当时肿瘤的进展，对免疫检测点调节类药物疗效的预测准确度不高。
技术实现思路
针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供一种用于预测免疫检测点调节类药物疗效的RT-PCR试剂盒及其预测方法，可有效解决现有方法无法预测免疫检测点调节类药物对肿瘤的疗效的问题。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于预测免疫检测点调节类药物疗效的RT-PCR试剂盒，该试剂盒包括用于进行RT-PCR扩增的引物及其辅助成分；所述引物包括首轮RT-PCR扩增引物，以及对首轮扩增产物TCR区域进行第二轮PCR扩增的特异性引物；首轮RT-PCR扩增引物如SEQIDNO.1～40所示；第二轮PCR扩增特异性引物如SEQIDNO.41～50所示。进一步地，辅助成分包括RT-PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、ddH2O、酶。采用上述试剂盒对免疫检测点调节类药物疗效进行检测的方法，包括以下步骤：(1)提取用药后的待测样品RNA；(2)以待测样品RNA模板进行反转录，然后对反转录制得的cDNA进行首轮RT-PCR扩增，收集纯化扩增产物；(3)再次对步骤(2)所得扩增产物进行第二轮PCR扩增，以扩增TCR可变区，获得可变区序列；(4)基于步骤(3)所得可变区序列计算其D50值。进一步地，步骤(4)中D50值的计算方法如下：测序得到TCR可变区序列信息，比对确定可变区序列的总数记为N，与可变区基因的不同序列的类型数为C，每一种序列的拷贝数为N1、N2……NC，并按拷贝数从多到少以N1、N2……NC进行排序，拷贝数最多且占据功能性可变区序列总数50％的克隆类型数记为H，H与C的比值即为D50。进一步地，当D50<0.01时，表明患者免疫力低下，使用免疫检测点调节类药物难以获得显著疗效；当0.01≤D50≤0.015，表明患者免疫力较差，使用免疫检测点调节类药物可能取得一定效果；当0.015<D50，表明患者免疫力相对较好，使用免疫检测点调节类药物有较大可能取得显著效果。其中，免疫检测点调节类药物疗效的定义为：完全缓解(CompleteRelease,CR)：所有靶病灶消失，无新病灶出现，且肿瘤标志物正常，至少维持4周。部分缓解(CompleteRelease,CR)：靶病灶最大径之和减少≥30％，至少维持4周。疾病稳定(StableDisease,SD)：靶病灶最大径之和缩小未达PR，或增大未达PD。疾病进展(ProgressiveDisease,PD)：靶病灶最大径之和至少增加≥20％，或出现新病灶。进一步地，使用TCR可变区互补决定区3(CDR3)确定TCR可变区序列唯一性。本专利技术的有益效果为：本专利技术基于高通量测序技术和目标区域特异性扩增技术，从受试者外周血分离淋巴细胞，提取RNA，逆转录获得cDNA，利用特异性引物扩增TCR可变区域，获得其序列信息，评估其多样性。实现了使用很少量外周血样本，在基因分子水平，对免疫检测点调节类药物疗效的预测评估。说明书附图图1为RNA提取质量检验；图2为TCR可变区扩增质量检验；图3为PD1抑制剂疗效与受试者D50分布关系；图4为根据受试者D50预测PD1抑制剂疗效。具体实施方式下面对本专利技术的具体实施方式进行描述，以便于本
的技术人员理解本专利技术，但应该清楚，本专利技术不限于具体实施方式的范围，对本
的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本专利技术的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本专利技术构思的专利技术创造均在保护之列。实施例1免疫图谱分析及免疫检测点调节类药物疗效预测方法的建立一、淋巴细胞分离和mRNA的提取1、淋巴细胞分离取6个受试者静脉血10mL，置于紫盖EDTA抗凝管中，用人淋巴细胞分离液(天津灏阳，货号LTS1077)分离淋巴细胞，具体操作步骤如下：(1)将采集的新鲜血液10mL加入50mL离心管中，加入生理盐水定容到25mL，轻轻吹打混匀。(2)在新的50mL离心管中，加入25mL的淋巴细胞分离液(等量)，然后用移液管吸取血样轻轻的沿本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于预测免疫检测点调节类药物疗效的RT-PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括用于进行RT-PCR扩增的引物及其辅助成分；所述引物包括首轮RT-PCR扩增引物，以及对首轮扩增产物TCR区域进行第二轮PCR扩增的特异性引物；/n所述首轮RT-PCR扩增引物如SEQ ID NO.1～40所示；所述第二轮PCR扩增特异性引物如SEQ ID NO.41～50所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于预测免疫检测点调节类药物疗效的RT-PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括用于进行RT-PCR扩增的引物及其辅助成分；所述引物包括首轮RT-PCR扩增引物，以及对首轮扩增产物TCR区域进行第二轮PCR扩增的特异性引物；
所述首轮RT-PCR扩增引物如SEQIDNO.1～40所示；所述第二轮PCR扩增特异性引物如SEQIDNO.41～50所示。


2.根据权利要求1所述的用于预测免疫检测点调节类药物疗效的RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述辅助成分包括RT-PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、ddH2O、酶。


3.采用权利要求1或2所述的试剂盒对免疫检测点调节类药物疗效进行预测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测样品RNA；
(2)以待测样品RNA模板进行反转录，然后对反转录制得的cDNA进行首轮RT-PCR扩增，收集纯化扩增产物；
(3)再次对步骤(2)所得扩增产物进行第二轮PCR扩增，以扩增TCR可变区，获得可变区序列；
(4)基于步骤(3)所得可变区序列计算其D5...

【专利技术属性】
技术研发人员：张志新，卓越，文学平，钟雪梅，
申请(专利权)人：成都益安博生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51