一种EWSR1-TFEB融合基因及其检测引物和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种EWSR1‑TFEB融合基因及其检测引物和应用。所述的融合基因包含SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。用于诊断EWSR1‑TFEB易位性肾细胞癌的引物组合物，为检测EWSR1‑TFEB基因易位的PCR引物；优选如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。EWSR1‑TFEB融合基因的引物在制备EWSR1‑TFEB易位性肾细胞癌诊断试剂中的应用。本发明专利技术克隆了一个TFEB的新易位伴侣，在TFEB易位性肾细胞癌中为首次报道。本发明专利技术针对高通量测序发现的新融合位点设计了特异性的PCR引物，扩大了原引物组合的检测范围，应用于临床，可提高诊断该类肿瘤的检出率和准确率。

A fusion gene of ewsr1-tfeb and its detection primer and Application

【技术实现步骤摘要】
一种EWSR1-TFEB融合基因及其检测引物和应用
本专利技术属于医学检验领域，涉及一种EWSR1-TFEB融合基因及其检测引物和应用。
技术介绍
2016年WHO对2004年肾细胞癌病理组织学分类进行了修改，新增了TFEB基因易位相关性肾癌(TFEB易位性肾癌)。TFEB基因位于6p21.1，是TFEB易位性肾癌的唯一驱动基因，其致病机理清晰明确：这类肿瘤均涉及位于6p21.1的TFEB基因同其它染色体易位及其所致形成融合基因，通过启动子变换从而高表达TFEB融合蛋白，而TFEB作为一个转录因子，通过与特异的DNA结构相结合，转录调控体内多种基因表达最终致病。目前WHO分类中仅纳入1种单一易位形式，即MALAT1-TFEB。然而近年来散在个案报道指出，TFEB易位性肾癌存在不同的易位伴侣和融合基因，包括KHDRBS2-TFEB,COL21A1-TFEB,CADM2-TFEB等。TFEB易位性肿瘤是一罕见类型肿瘤，虽然其总体发病率很低，但该疾病以发病年龄轻为突出特征，因此造成极其沉重的家庭及社会负担。且研究表明，该肿瘤与肾脏常见肿瘤(透明细胞性肾细胞癌)无论从发病机制还是激活的信号通路上均存在显著差别，因而临床治疗指南亦对其治疗方案有所区分，TFEB易位性肿瘤的治疗靶点亟待进一步研究。因此，根据基因型来精确诊断此类肿瘤显得十分重要。目前常用的诊断TFEB易位性肿瘤的检测方法主要包括免疫组织化学和荧光原位杂交。免疫组织化学检测细胞核TFEB融合蛋白直观、快捷、价格低，但其缺点是该方法容易受到多种因素影响，如组织固定时间、组织修复方式、抗体克隆号以及人为的判读因素等等，使得结果可能出现假阳性或假阴性。染色体荧光原位杂交(FISH)始于传统的细胞遗传学和DNA技术的结合，快速灵敏、特异性好，可以检测隐匿或微小的染色体畸变以及复杂核型；还可以使用多种荧光标记，显示DNA片段及基因之间的相对位置与方向，空间定位精确。但这两种检测方法只能提示存在TFEB蛋白的高表达或TFEB基因的易位，均不能明确肿瘤中发生的具体易位改变。精确检测TFEB易位性肿瘤的易位伴侣和融合基因位点，不仅是患者预后预测的依据，也是未来靶向治疗的指导，因此，明确TFEB易位性肿瘤的基因易位位点，具有重要的临床意义。目前高通量测序是唯一可以明确未知易位位点的检测手段，然而高通量测序费用高昂，检测周期长，检测平台稀缺，对样品质量要求高，不利于普及推广，对于大多数患者来说也不是首选检测手段。依赖以往经验，针对已知的融合位点设计特异性的PCR引物组合，对肿瘤组织中提取出的RNA逆转录之后进行PCR扩增并测序，检测融合基因具体易位位点，是最准确、便捷、经济的方法。因此，发现新的致病融合位点，进而设计PCR引物将有利于TFEB易位性肿瘤检测准确度的进一步提高。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种TFEB的新易位伴侣。本专利技术的另一目的是提供该新易位伴侣的检测引物。本专利技术的又一目的是提供引物的应用。本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：一种TFEB的新易位伴侣，为EWSR1-TFEB基因易位，EWSR1基因位于22q12.2(22号染色体，位置29,663,998-29,696,515，序列来自GeneBank，序列版本号GRCh37/hg19)，共19个外显子；TFEB基因位于6p21.1(6号染色体，位置41,651,716-41,703,997，序列来自GeneBank，序列版本号GRCh37/hg19),共17个外显子。基因融合发生于EWSR1的6号外显子与TFEB基因5号外显子之间。我们通过高通量测序方法检测未知融合对象的TFEB肿瘤患者的标本，发现所述的TFEB的新易位伴侣：EWSR1-TFEB基因易位，包含SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。EWSR1是许多软组织肿瘤中常见的发生易位的基因，但在本专利所述TFEB易位性肾细胞癌中，这一易位对象国内外尚未见报道。本专利技术所述的EWSR1-TFEB融合基因(或称EWSR1-TFEB基因易位)的检测试剂在制备EWSR1-TFEB易位性肾细胞癌诊断试剂中的应用。所述的EWSR1-TFEB融合基因的检测试剂为检测EWSR1-TFEB融合基因的引物组合物。所有能够检测本专利技术所述EWSR1-TFEB基因易位的引物对均在本专利技术的保护范围内；优选上游引物EWSR1-E6-F如SEQIDNO.1所示，下游引物TFEB-E5-R如SEQIDNO.2所示。一种用于诊断EWSR1-TFEB易位性肾细胞癌的引物组合物，为检测本专利技术所述的EWSR1-TFEB基因易位的PCR引物；优选上游引物EWSR1-E6-F如SEQIDNO.1所示，下游引物TFEB-E5-R如SEQIDNO.2所示。针对本专利技术找到的新的新易位伴侣，我们在EWSR1的6号外显子和TFEB的5号外显子内分别设计引物。遵循引物设计原则，引物最好在模板cDNA的保守区内设计，引物长度在15bp-30bp之间，引物GC含量在40％～60％之间，退火温度最好接近72℃，引物自身及引物之间不应存在互补序列，扩增条带单一特异。由于工作中经常需要在石蜡固定标本中开展工作，石蜡标本RNA碎裂严重，因此扩增产物不宜过长，需要控制在350bp以下。经过多次调试和验证，最终设计的引物序列为：EWSR1-E6-F：TCTAGCACAGGGGGTTACAAC；(SEQIDNO.1)；TFEB-E5-R:CTTTCTTCTGCCGCTCCTT(SEQIDNO.2)，理论产物长度326bp，扩增产物(融合基因)的全部序列如下：TCTAGCACAGGGGGTTACAACCAGCCCAGCCTAGGATATGGACAGAGTAACTACAGTTATCCCCAGGTACCTGGGAGCTACCCCATGCAGCCAGTCACTGCACCTCCATCCTACCCTCCTACCAGCTACCCCTGTCCAGCAGCCACCTGAATGTGTACAGCAGCGACCCCCAGGTCACAGCCTCCCTGGTGGGCGTCACCAGCAGCTCCTGCCCTGCGGACCTGACCCAGAAGCGAGAGCTCACAGGTACTGCCGCTCCTCTCTCCTTCTCTTTTGGCCTCCAGATGCTGAGAGCAGGGCCCTGGCCAAGGAGCGGCAGAAGAAAG(SEQIDNO.3)。经实验验证，引物可成功扩增出目的条带，条带单一、特异(图1)。验证病例实际扩增产物长度269bp，融合基因序列如下:TCTAGCACAGGGGGTTACAACCAGCCCAGCCTAGGATATGGACAGAGTAACTACAGTTATCCCCAGGTCTACCCCTGTCCAGCAGCCACCTGAATGTGTACAGCAGCGACCCCCAGGTCACAGCCTCCCTGGTGGGCGTCACCAGCAGCTCCTGCCCTGCGGACCTGACCCAGAAGCGAGAGCTCACAGG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种EWSR1-TFEB融合基因，其特征在于，所述的融合基因包含SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种EWSR1-TFEB融合基因，其特征在于，所述的融合基因包含SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。


2.权利要求1所述的EWSR1-TFEB融合基因的检测试剂在制备EWSR1-TFEB易位性肾细胞癌诊断试剂中的应用。


3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的EWSR1-TFEB融合基因的检测试剂为检测EWSR1-TFEB融合基因的引物组合物。


4.一种用于诊断EWSR1-TFEB易位性肾细胞癌的引物组合物，...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶秋，夏秋媛，叶胜兵，李锐，王璇，魏雪，
申请(专利权)人：中国人民解放军东部战区总医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32