一种用于消化道肿瘤早期诊断、筛查或检测的多基因检测引物探针组、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种用于消化道肿瘤早期诊断、筛查或检测的多基因检测引物探针组，属于生物医学领域。所述引物探针组包括选自以下五组引物和探针中的至少两组：（1）甲基化的SDC2基因的正向引物、反向引物、Blocker引物和探针；（2）甲基化的SFRP2基因的正向引物、反向引物、Blocker引物和探针；（3）甲基化的SEPT9基因的正向引物、反向引物、Blocker引物和探针；（4）甲基化的CADM1基因的正向引物、反向引物、Blocker引物和探针；（5）甲基化的PAX1基因的正向引物、反向引物、Blocker引物和探针。本发明专利技术同时检测两个或两个以上甲基化标记物，灵敏度高、特异性好、检测方便、成本低，可用于消化道肿瘤的早期筛查和辅助诊断。

A multi gene detection primer probe set, kit and its application for early diagnosis, screening or detection of gastrointestinal tumors

The invention provides a multi gene detection primer probe group for early diagnosis, screening or detection of digestive tract tumors, belonging to the biomedical field. The primer probe group includes at least two groups selected from the following five groups of primers and probes: (1) forward primer, reverse primer, blocker primer and probe of methylated sdc2 gene; (2) forward primer, reverse primer, blocker primer and probe of methylated SFRP2 gene; (3) forward primer, reverse primer, blocker primer and probe of methylated SEPT9 gene; (4) \uff09The forward primer, reverse primer, blocker primer and probe of methylated CADM1 gene; (5) the forward primer, reverse primer, blocker primer and probe of methylated Pax1 gene. The invention can detect two or more methylation markers at the same time, with high sensitivity, good specificity, convenient detection and low cost, and can be used for early screening and auxiliary diagnosis of digestive tract tumors.

【技术实现步骤摘要】
一种用于消化道肿瘤早期诊断、筛查或检测的多基因检测引物探针组、试剂盒及其应用
本专利技术属于生物医学领域，具体涉及一种用于消化道肿瘤早期诊断、筛查或检测的多基因检测引物探针组、试剂盒及其应用。
技术介绍
消化道肿瘤(肝癌、胰腺癌、食管癌、胃癌和结直肠癌)均是中国人群最常见的恶性肿瘤，2015年中国癌症统计数据显示肝癌、结食管癌、胃癌和结直肠癌均位列中国男性和女性癌症发病类型的前五位，其中肝癌高居中国癌症死亡率的第二位。当前消化道癌的早期诊治比例不足20％，在生存期方面，I期患者的5年生存率可达90％以上，而IV期患者只有略大于10％的生存率。因此，实现消化道癌的早期筛查和早诊早治对于提高患者的生存率进而提升全民健康水平有着重要意义。当前胃癌和食管癌早期筛查手段主要是内窥镜，但由于该方法对操作者要求高，难以推广，同时作为一种侵入性的检查方式，患者的接受度较低，导致中国的胃癌和食管癌早期发现率远低于发达国家水平。而肝癌和胰腺癌目前尚无一种有效早期筛查手段，因此往往发现时都已经到了中晚期。非正常DNA甲基化在癌症的诱发和维持中起着重要作用，使之成为很多癌症的很好的生物标志物。游离循环肿瘤DNA(ctDNA)是由肿瘤细胞坏死或者凋亡后释放到体液中的单链或者双链DNA，对ctDNA进行检测，可以对肿瘤进行实时监控、早期诊断与预后判断等。但是目前通过单一甲基化ctDNA所开发的产品和相关研究报道在检出灵敏度上都不高，因此难以作为消化道肿瘤早期初筛的有效方法。
技术实现思路
由于消化道发育来自同一胚层，因此在组织结构上有很大的相似性，而且发病状态、筛查人群和筛查方式都有很大的相似性，本申请人考虑可以利用多基因甲基化检测联合技术开发一种针对消化道肿瘤的特异性的早期筛查试剂盒。因此，本专利技术的目的在于提供一种适用于多种消化道肿瘤早期诊断、筛查或检测的多基因检测引物探针组、试剂盒及其应用，以解决针对当前单一甲基化ctDNA所开发的产品检出灵敏度不高、难以作为消化道肿瘤早期筛查或诊断的有效方法等问题。为实现上述目的，一方面，本专利技术提供了一种用于消化道肿瘤早期诊断、筛查或检测的多基因检测引物探针组，该多基因检测引物探针组包括选自以下五组引物和探针中的至少两组：(1)甲基化的SDC2基因的正向引物、反向引物、Blocker引物和探针；(2)甲基化的SFRP2基因的正向引物、反向引物、Blocker引物和探针；(3)甲基化的SEPT9基因的正向引物、反向引物、Blocker引物和探针；(4)甲基化的CADM1基因的正向引物、反向引物、Blocker引物和探针；(5)甲基化的PAX1基因的正向引物、反向引物、Blocker引物和探针。进一步的，所述甲基化的SDC2基因的正向引物选自SEQIDNO：1～3中的任意一条、反向引物选自SEQIDNO：4～6中的任意一条、Blocker引物选自SEQIDNO：7～9中的任意一条、探针选自SEQIDNO：10～12中的任意一条。进一步的，所述甲基化的SFRP2基因的正向引物选自SEQIDNO：13～15中的任意一条、反向引物选自SEQIDNO：16～18中的任意一条、Blocker引物选自SEQIDNO：19～21中的任意一条、探针选自SEQIDNO：22～24中的任意一条。进一步的，所述甲基化的SEPT9基因的正向引物选自SEQIDNO：37～39中的任意一条、反向引物选自SEQIDNO：40～42中的任意一条、Blocker引物选自SEQIDNO：43～45中的任意一条、探针选自SEQIDNO：46～48中的任意一条。进一步的，所述甲基化的CADM1基因的正向引物选自SEQIDNO：25～27中的任意一条、反向引物选自SEQIDNO：28～30中的任意一条、Blocker引物选自SEQIDNO：31～33中的任意一条、探针选自SEQIDNO：34～36中的任意一条。进一步的，所述甲基化的PAX1基因的正向引物选自SEQIDNO：49～51中的任意一条、反向引物选自SEQIDNO：52～54中的任意一条、Blocker引物选自SEQIDNO：55～57中的任意一条、探针选自SEQIDNO：58～60中的任意一条。另一方面，本专利技术提供了一种用于消化道肿瘤早期诊断、筛查或检测的试剂盒，该试剂盒包含上述用于消化道肿瘤早期诊断、筛查或检测的多基因检测引物探针组。进一步的，所述试剂盒还包括一组内参基因的正向引物、反向引物和探针，所述内参基因选自ACTB、GAPDH和HBB中的任意一个，所述ACTB的正向引物为SEQIDNO:61所示序列、反向引物为SEQIDNO:62所示序列、探针为SEQIDNO:63所示序列；所述GAPDH的正向引物为SEQIDNO:64所示序列、反向引物为SEQIDNO:65所示序列、探针为SEQIDNO:66所示序列；所述HBB的正向引物为SEQIDNO:67所示序列、反向引物为SEQIDNO:68所示序列、探针为SEQIDNO:69所示序列。进一步的，所述试剂盒检测的样本为由人源样本经过基因组DNA提取、经亚硫酸盐转化及纯化后获得的DNA样本，其中所述人源样本选自血液、粪便、唾液、痰液以及组织中的一种或多种。另一方面，本专利技术提供了上述试剂盒作为检测、诊断或筛查消化道肿瘤或消化道癌前病变试剂的应用。进一步的，所述消化道肿瘤包括胃癌、食管癌、肝癌、结直肠癌和胰腺癌，所述消化道癌前病变包含结直肠腺瘤性息肉、食管腺瘤性息肉、胃腺瘤性息肉、胃腺体肠化生、胃高等级不典型增生、食管高等级不典型增生、结直肠高等级不典型增生以及上述各类消化道组织高等级上皮内瘤变。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益技术效果：本专利技术同时检测生物样本中与消化道癌或消化道癌前病变相关的两个或两个以上甲基化标记物，具有灵敏度高、特异性好、检出率高、检测方便以及成本低等优势，可用于消化道肿瘤的早期筛查和辅助诊断，实现消化道肿瘤的无创检测，进而实现消化道肿瘤的早诊早治。附图说明图1为甲基化CADM1和HBB引物探针组检测甲基化阳性样本扩增曲线图；图2为甲基化PAX1和GAPDH引物探针组检测甲基化阳性样本扩增曲线图；图3为甲基化SDC2和甲基化SEPT9引物探针组检测41例上消化道癌(10例食管癌和31例胃癌)血清样本和36例正常对照组血清样本的ROC曲线；图4为甲基化SDC2和甲基化SFRP2引物探针组检测122例结直肠癌和91例正常对照组样本的ROC曲线。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本专利技术的技术方案，而不能以此来限制本专利技术的保护范围。一、引物和探针表1各引物和探针序列二、试剂盒的组分1、多基因检测引物探针组本专利技术的多基因检测引物探针组包括：甲基化的SDC2基因、SFRP2基因、CADM1基因、SEP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于消化道肿瘤早期诊断、筛查或检测的多基因检测引物探针组，其特征在于，包括选自以下五组引物和探针中的至少两组：/n（1）甲基化的SDC2基因的正向引物、反向引物、Blocker引物和探针；/n（2）甲基化的SFRP2基因的正向引物、反向引物、Blocker引物和探针；/n（3）甲基化的SEPT9基因的正向引物、反向引物、Blocker引物和探针；/n（4）甲基化的CADM1基因的正向引物、反向引物、Blocker引物和探针；/n（5）甲基化的PAX1基因的正向引物、反向引物、Blocker引物和探针。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于消化道肿瘤早期诊断、筛查或检测的多基因检测引物探针组，其特征在于，包括选自以下五组引物和探针中的至少两组：
（1）甲基化的SDC2基因的正向引物、反向引物、Blocker引物和探针；
（2）甲基化的SFRP2基因的正向引物、反向引物、Blocker引物和探针；
（3）甲基化的SEPT9基因的正向引物、反向引物、Blocker引物和探针；
（4）甲基化的CADM1基因的正向引物、反向引物、Blocker引物和探针；
（5）甲基化的PAX1基因的正向引物、反向引物、Blocker引物和探针。


2.根据权利要求1所述的多基因检测引物探针组，其特征在于，所述甲基化的SDC2基因的正向引物选自SEQIDNO：1~3中的任意一条、反向引物选自SEQIDNO：4~6中的任意一条、Blocker引物选自SEQIDNO：7~9中的任意一条、探针选自SEQIDNO：10~12中的任意一条。


3.根据权利要求1所述的多基因检测引物探针组，其特征在于，所述甲基化的SFRP2基因的正向引物选自SEQIDNO：13~15中的任意一条、反向引物选自SEQIDNO：16~18中的任意一条、Blocker引物选自SEQIDNO：19~21中的任意一条、探针选自SEQIDNO：22~24中的任意一条。


4.根据权利要求1所述的多基因检测引物探针组，其特征在于，所述甲基化的SEPT9基因的正向引物选自SEQIDNO：37~39中的任意一条、反向引物选自SEQIDNO：40~42中的任意一条、Blocker引物选自SEQIDNO：43~45中的任意一条、探针选自SEQIDNO：46~48中的任意一条。


5.根据权利要求1所述的多基因检测引物探针组，其特征在于，所述甲基化的CADM1基因的正向引物选自SEQIDNO：25~27中的任意一条、反向引物选自SEQIDNO：28~30中的任意一条、Blocker引物选自SEQIDNO：...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵国栋，熊尚岷，
申请(专利权)人：苏州唯善生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32