利用荧光定量PCR检测MEF2D基因重排的引物和探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种利用荧光定量PCR检测MEF2D基因重排的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：RNA提取试剂、逆转录试剂、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品，能够对人类B‑ALL中MEF2D基因重排进行检测，可有效的节约检测时间，提高检测精度，有助于临床上B‑ALL患者体内MEF2D基因重排的检测，对于分型诊断、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。

Primers, probes and kits for detection of MEF2D gene rearrangement by fluorescence quantitative PCR

The invention discloses a kit for detecting MEF2D gene rearrangement by fluorescence quantitative PCR, which is characterized in that the kit includes RNA extraction reagent, reverse transcription reagent, detection system PCR reaction solution, positive control substance and negative control substance, which can detect MEF2D gene rearrangement in human B \u2011 all, can effectively save detection time, improve detection accuracy, and is helpful for clinical use The detection of MEF2D gene rearrangement in patients with bed-b \u2011 all is of great significance for typing diagnosis, adjusting treatment plan, evaluating treatment effect, predicting prognosis and preventing clinical recurrence.

【技术实现步骤摘要】
利用荧光定量PCR检测MEF2D基因重排的引物和探针及试剂盒
本专利技术属于生命科学和生物
，涉及一种临床检验用途的基因检测方法，采用探针实时荧光PCR技术，能够对人类B-ALL中MEF2D基因重排进行检测，可有效的节约检测时间，提高检测精度。
技术介绍
白血病是一组高度异质性造血系统恶性肿瘤，其病因和发病机制至今未明。目前发现细胞遗传学改变在白血病发生中起重要作用，常见细胞遗传学异常如染色体数目改变、染色体易位和原癌基因异常表达等。它们通过改变造血细胞的自我更新、增殖和分化机制导致造血干细胞或定向祖细胞向白血病细胞转化。随着免疫学、分子生物学、分子细胞遗传学的飞速发展，人们对白血病发生的分子机制有了更深入的认识，发现了一些特异的、与疾病诊断和预后密切相关的基因改变，如伴有t(15；17)(q22；q21)的急性早幼粒细胞白血病、伴有t(8；21)(q22；q22)和inv(16)(p13；q22)或t(16；16)(p13；q22)的急性髓系白血病等。除了常见的染色体易位类型外，还存在一些染色体异常发生率较低，但对白血病的分型诊断及预后均有重要价值。肌细胞增强因子2D(Myocyteenhancerfactor,MEF2D)基因位于1q22，是近年来在ALL中鉴定出的一种基因重排，主要有5种基因融合：BCL9(1q21)、HNRNPUL1(19q13.2)、DAZAP1(19p13.3)、CSF1R(5q32)及SS18(18q11.2)。MEF2D相关融合基因主要发生在儿童和青少年B-ALL，发生率约2.4％。MEF2D是机体内重要的转录因子，可参与调控肌肉及神经细胞的分化及发展。研究发现MEF2D基因重排可增强其转录活性和淋巴转换，因此可能导致一种高风险白血病亚型。虽然MEF2D基因重排的发生率远小于BCL-ABL等常见类型，发生率仅在2％左右，但是携带不同类型基因重排的白血病发病机制不同，细胞遗传学和分子生物学的诊断标准不同，其治疗方案及预后亦有不同，所以检测MEF2D基因重排在白血病特别是B-ALL的分型诊断和治疗方案及预后评估中起到重要作用。MEF2D基因重排检测的常用技术有荧光原位杂交技术(FISH)、RQ-PCR等方法。FISH检测结果较为直观，但是试验过程繁琐，涉及试剂种类繁多，费时费力，且结果需经验丰富的专业人士来判读，结果判读存在较大的主观性。RQ-PCR采用Taqman探针荧光定量技术，综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，其结果用拷贝数表示，实现了对PCR产物的准确定量，易于统一标准，与定性PCR技术相比，具有特异度好，灵敏度高，线性关系好，操作简单，自动化程度高、防污染，有较大的线性范围等优点。能够满足MEF2D基因重排的检测，被认为是目前首选检测方法，用于评价治疗效果、预测预后。实时荧光定量PCR中常见的方法有SYBRGreenI染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBRGreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针杂交法成本又较为昂贵。因此本研究采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针法应用于MEF2D的基因重排检测。
技术实现思路
针对现有技术的缺陷，本专利技术公开了一种利用荧光定量PCR检测MEF2D基因重排的引物和探针及试剂盒，能够对人类B-ALL中MEF2D基因重排进行检测，可有效的节约检测时间，提高检测精度。利用荧光定量PCR检测MEF2D基因重排的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的碱基序列如下：MEF2D-BCL9(5-6/9)-F：TAATAGAGAGTGGGTTCTGGGAMEF2D-BCL9(5-6/9)-Probe：FAM-AGACTTCCAGGGATATTCACAGAGGC-BHQ1MEF2D-BCL9(5-6/9)-R：GCCAGCACTACAGAGGAACAMEF2D-BCL9(5-6/10)-F：ATTGGGCTGAGGGTTGGMEF2D-BCL9(5-6/10)-Probe：FAM-CGGAACCACGGGGTTTGGACC-BHQ1MEF2D-BCL9(5-6/10)-R：GCCAGCACTACAGAGGAACAMED2F-HNRNPUL1-F：ACGCCGAGTTTACTCAGCCMED2F-HNRNPUL1/SS18-Probe：FAM-TCCATGCCCACTGCCTACAACAC-BHQ1MED2F-HNRNPUL1-R：CCAGGAAGTCCCCAACATCTMED2F-SS18-F：TGGCAACGCCGAGTTTACTMED2F-SS18-R：TTGACCCATCATTCCCATAGGMED2F-DAZAP1-FTAACTTCCACTTTTTTGCCCATMED2F-DAZAP1-Probe：FAM-TGGTCCACTGATTGTTCGTCCTCG-BHQ1MED2F-DAZAP1-R：AGCGGCCAGCTAGTGCGMED2F-CSF1R-F：CCAGGCAGGAAAGGGGTTMED2F-CSF1R-Probe：FAM-TGAAGCCCAAGTACCAGGTCCGC-BHQ1MED2F-CSF1R-R：GCGTGGGGTCGATGAAAG。进一步地，所述引物和探针还包括检测ABL内参基因的引物和探针，分别为：Abl-F:GATACGAAGGGAGGGTGTACCAAbl-R:CTCGGCCAGGGTGTTGAAAbl-Probe:FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-BHQ1。本专利技术还提供一种利用荧光定量PCR检测MEF2D基因重排的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：RNA提取试剂、逆转录试剂、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；其中检测体系PCR反应液包括：(1)检测目的基因用上下游引物以及探针，其序列如下：MEF2D-BCL9(5-6/9)-F：TAATAGAGAGTGGGTTCTGGGAMEF2D-BCL9(5-6/9)-Probe：FAM-AGACTTCCAGGGATATTCACAGAGGC-BHQ1MEF2D-BCL9(5-6/9)-R：GCCAGCACTACAGAGGAACAMEF2D-BCL9(5-6/10)-F：ATTGGGCTGAGGGTTGGMEF2D-BCL9(5-6/10)-Probe：FAM-CGGAACCACGGGGTTTGGACC-BHQ1MEF2D-BCL9(5-6/10)-R：GCCAGCACTACAGAGGAACAMED2F-HNRNPUL1-F：ACGCCGAGTTTACTCAGCC<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用荧光定量PCR检测MEF2D基因重排的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的碱基序列如下：/nMEF2D-BCL9(5-6/9)-F：TAATAGAGAGTGGGTTCTGGGA/nMEF2D-BCL9(5-6/9)-Probe：/nFAM-AGACTTCCAGGGATATTCACAGAGGC-BHQ1/nMEF2D-BCL9(5-6/9)-R：GCCAGCACTACAGAGGAACA/nMEF2D-BCL9(5-6/10)-F：ATTGGGCTGAGGGTTGG/nMEF2D-BCL9(5-6/10)-Probe：FAM-CGGAACCACGGGGTTTGGACC-BHQ1/nMEF2D-BCL9(5-6/10)-R：GCCAGCACTACAGAGGAACA/nMED2F-HNRNPUL1-F：ACGCCGAGTTTACTCAGCC/nMED2F-HNRNPUL1/SS18-Probe：/nFAM-TCCATGCCCACTGCCTACAACAC-BHQ1/nMED2F-HNRNPUL1-R：CCAGGAAGTCCCCAACATCT/nMED2F-SS18-F：TGGCAACGCCGAGTTTACT/nMED2F-SS18-R：TTGACCCATCATTCCCATAGG/nMED2F-DAZAP1-F TAACTTCCACTTTTTTGCCCAT/nMED2F-DAZAP1-Probe：FAM-TGGTCCACTGATTGTTCGTCCTCG-BHQ1/nMED2F-DAZAP1-R：AGCGGCCAGCTAGTGCG/nMED2F-CSF1R-F：CCAGGCAGGAAAGGGGTT/nMED2F-CSF1R-Probe：FAM-TGAAGCCCAAGTACCAGGTCCGC-BHQ1/nMED2F-CSF1R-R：GCGTGGGGTCGATGAAAG。/n...

【技术特征摘要】
1.利用荧光定量PCR检测MEF2D基因重排的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的碱基序列如下：
MEF2D-BCL9(5-6/9)-F：TAATAGAGAGTGGGTTCTGGGA
MEF2D-BCL9(5-6/9)-Probe：
FAM-AGACTTCCAGGGATATTCACAGAGGC-BHQ1
MEF2D-BCL9(5-6/9)-R：GCCAGCACTACAGAGGAACA
MEF2D-BCL9(5-6/10)-F：ATTGGGCTGAGGGTTGG
MEF2D-BCL9(5-6/10)-Probe：FAM-CGGAACCACGGGGTTTGGACC-BHQ1
MEF2D-BCL9(5-6/10)-R：GCCAGCACTACAGAGGAACA
MED2F-HNRNPUL1-F：ACGCCGAGTTTACTCAGCC
MED2F-HNRNPUL1/SS18-Probe：
FAM-TCCATGCCCACTGCCTACAACAC-BHQ1
MED2F-HNRNPUL1-R：CCAGGAAGTCCCCAACATCT
MED2F-SS18-F：TGGCAACGCCGAGTTTACT
MED2F-SS18-R：TTGACCCATCATTCCCATAGG
MED2F-DAZAP1-FTAACTTCCACTTTTTTGCCCAT
MED2F-DAZAP1-Probe：FAM-TGGTCCACTGATTGTTCGTCCTCG-BHQ1
MED2F-DAZAP1-R：AGCGGCCAGCTAGTGCG
MED2F-CSF1R-F：CCAGGCAGGAAAGGGGTT
MED2F-CSF1R-Probe：FAM-TGAAGCCCAAGTACCAGGTCCGC-BHQ1
MED2F-CSF1R-R：GCGTGGGGTCGATGAAAG。


2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物和探针还包括检测ABL内参基因的引物和探针，分别为：
Abl-F:GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
Abl-R:CTCGGCCAGGGTGTTGAA
Abl-Probe:FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-BHQ1。


3.利用荧光定量PCR检测MEF2D基因重排的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：RNA提取试剂、逆转录试剂、检测体系PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛林梅，裘振亚，王淑一，
申请(专利权)人：杭州艾迪康医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33