一组用于非超突变型直肠癌分子分型的基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一组用于非超突变型直肠癌分子分型的基因，包含SMAD4基因、MUC16基因、FAT4基因、FLG基因、ROBO2基因、NEB基因；根据该基因突变特征组合可对直肠癌进行分子分型，从而筛选在术后复发和死亡风险较低的低危组患者，可按照目前的术后辅助治疗方案进行治疗，避免过度治疗；而另一组术后复发和死亡风险较高的高危组患者，可在目前的术后辅助治疗方案基础上为患者寻找更佳的其他方案。本发明专利技术还公开了用于捕获上述基因的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
一组用于非超突变型直肠癌分子分型的基因及其应用
本专利技术属于生物
，涉及一组用于非超突变型直肠癌分子分型的基因，及该组基因在预判直肠癌术后复发转移上的应用。
技术介绍
恶性肿瘤目前已成为一个全球性公共健康问题。近三十年以来，癌症发病数以年均3％-5％的速度递增，癌症已成为人类第一位死因。结直肠癌是我国常见癌症之一。近几十年来，结直肠癌发病率年均上升3％～4％，但地区差异较大，如上海2012年发病率达56/10万。世界卫生组织国家癌症研究代表处(InternatinalAgencyforResearchonCancer,IARC)发表的Globocan2012估算中国大陆结直肠癌标化发病率为14.2/10万，居世界第75位，标化病死率7.4/10万，据世界第78位。我国结直肠癌发病率和死亡例数分别占全世界发病和死亡总例数的18.6％和20.1％，均居第1位。根据国家癌症中心全国肿瘤登记数据报告，我国城市和农村地区结直肠癌发病率分别列所有恶性肿瘤的第3位及第5位，病死率分别居第4位和第5位。在农村地区，直肠癌在发病和死亡构成中所占比例略高于结肠癌。手术、化疗和放疗是传统的癌症治疗手段，目前多数早期患者通过综合治疗后可以获得较好的预后，但这些治疗无法降低所有肿瘤患者的死亡率。主要原因是手术治疗后发生的肿瘤复发或转移，最终导致患者死亡。当前的临床实践中所有的III期肠癌都推荐规范的辅助化疗，一般为含奥沙利铂的联合方案，临床医生根据患者具体情况再做调整。但同一个分期的患者预后可以存在较大差别，不是所有的直肠癌患者都能从术后辅助化疗中受益。因此建立一个区分患者复发和死亡风险度的方法，为个体化辅助治疗提供依据，迫在眉睫。目前，CN108342483A提供了一组五基因组合的用于非超突变型结直肠癌分子分型，但该基因组在非超突变型直肠癌上应用效果不佳，无法区分预后较好和预后较差的患者，也无法区分非超突变型直肠癌患者复发和死亡率风险度。因此，针对非超突变型直肠癌建立一个区分患者复发和死亡风险度的方法，为个体化辅助治疗提供依据，也是迫切需要的。
技术实现思路
本专利技术针对直肠癌患者在术后可能发生肿瘤复发或转移，最终导致患者死亡的问题，提供了一组用于预判非超突变型直肠癌术后复发转移的基因及其检测试剂盒。本专利技术提供一组用于非超突变型直肠癌分子分型的基因，包括如下基因：SMAD4基因、MUC16基因、FAT4基因、FLG基因、ROBO2基因、NEB基因。本专利技术提供一种用于非超突变型直肠癌分子分型的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括捕获本专利技术所述用于直肠癌分子分型的基因的探针。其中，所述的检测试剂盒较佳地还包括：基因组DNA提取试剂、文库构建试剂、二代测序试剂，选自末端修复酶、末端修复反应缓冲液、DNA连接酶、连接反应缓冲液、含分子标签的接头、文库扩增引物、PCR预混液、接头封闭剂、DNA封闭剂、杂交缓冲液、杂交增强剂、磁珠洗液、杂交洗液、捕获文库PCR引物、质控品、核酸纯化磁珠和链霉亲合素磁珠的一种或多种试剂。其中，所述基因组DNA提取试剂为本领域常规的基因组DNA提取试剂。其中，所述文库构建试剂和二代测序试剂为本领域常规使用的试剂，只要能满足对所得序列构建文库并进行二代测序的要求即可。所述的二代测序为本领域常规的二代测序。本专利技术所述的检测试剂盒较佳地还包括从检测对象提取检测样本的器械；更佳地，还包括从检测对象或肿瘤患者体内提取组织或血液的器械，所述器械较佳地为任何能用于取血的釆血针、注射器等。本专利技术所述的检测样本较佳地为来自检测对象的组织，只要能从检测样本中抽提检测对象的基因组DNA即可。所述检测样本较佳地为组织样本、血液、血浆和体液中的一种或几种，更佳地为组织样本，更佳地为石蜡组织样本，优选地为肿瘤细胞含量高的组织。本专利技术所述检测试剂盒适用于对确定为非超突变型直肠癌进行进一步检测，使用方法包括以下步骤：(1)提取血液和组织样本中的基因组DNA双链核酸；(2)将步骤(1)的所述DNA双链核酸变性处理得到DNA单链，使用捕获探针捕获SMAD4基因、MUC16基因、FAT4基因、FLG基因、ROBO2基因、NEB基因；捕获区域分别如下(参考基因组版本为GRCh37/hg19)：针对捕获对象设计探针为本领域的常用技术手段，探针的序列包括但不限于如上表所示区域。(3)将步骤(2)所捕获的DNA单链进行测序，得到血液和组织样本中的核酸序列；(4)将步骤(3)所得到的核酸序列进行自动化处理，计算组织样本中的6个基因的变异位点数量。若合计变异位点数量为0，则为6基因野生型；若合计变异位点数量大于0，则为6基因突变型。其中步骤(1-4)所述的提取方法、文库构建、测序方法和基因变异位点计算方法均为本领域常规方法。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。本专利技术所用试剂和原料均市售可得。本专利技术所取得的有益效果是：本专利技术首次提出了非超突变型直肠癌的复发和死亡风险标志物，该组标志物可用于区分预后较差和预后较好的患者，提示患者在术后发生复发转移的可能性，筛选在术后复发和死亡风险较低的低危组患者，可按照目前的术后辅助治疗方案进行治疗，避免过度治疗；而另一组术后复发和死亡风险较高的高危组患者，可在目前的术后辅助治疗方案基础上为患者寻找更佳的其他方案，有较好的临床指导意义。附图说明图1显示了6基因模型与非超突变型直肠癌患者(ZJU数据集)术后生存时间的分析结果。与6基因野生型组的患者相比，6基因突变型组的患者预后更差，死亡风险更高。图2显示了6基因模型与非超突变型直肠癌患者(TCGA数据集)术后生存时间的分析结果。与6基因野生型组的患者相比，6基因突变型组的患者预后更差，死亡风险更高。图3显示了对非超突变型直肠癌患者(TCGA数据集)，随机选取6个基因，进行了10000次多重置换检验的结果，并与本专利技术的6基因模型的Log10(P值)比较。结果说明本专利技术的6基因预后预测模型显著优于随机选择的同样数量基因的预后预测模型。图4显示了6基因突变型的非超突变型III期直肠癌(混合数据集)术后生存时间的分析结果。与6基因野生型组的患者相比，6基因突变型组的患者预后更差，死亡风险更高。图5显示了5基因模型与非超突变型直肠癌患者(ZJU数据集)术后生存时间的分析结果。图6显示了5基因模型与非超突变型直肠癌患者(TCGA数据集)术后生存时间的分析结果。具体实施方式本专利技术对直肠癌的基因组突变谱进行了深入分析，筛选得到了一组直肠癌基因突变特征和组合，并在独立的直肠癌队列上做了验证，根据该基因突变特征组合可对直肠癌进行分子分型，从而筛选在术后复发和死亡风险较低的低危组患者，可按照目前的术后辅助治疗方案进行治疗，避免过度治疗；而另一组术后复发和死亡风险较高的高危组患者，可在目前的术后辅助治疗方案基础上为患者寻找更佳的其他方案。...

【技术保护点】
1.一组用于非超突变型直肠癌分子分型的基因，其特征在于，包含如下基因：SMAD4基因、MUC16基因、FAT4基因、FLG基因、ROBO2基因、NEB基因。/n

【技术特征摘要】
1.一组用于非超突变型直肠癌分子分型的基因，其特征在于，包含如下基因：SMAD4基因、MUC16基因、FAT4基因、FLG基因、ROBO2基因、NEB基因。


2.如权利要求1所述的一组基因在制备用于非超突变型直肠癌分子分型的试剂盒中的应用。


3.一种用于非超突变型直肠癌分子分型的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括：捕获权利要求1中所述基因的探针。


4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述探针的捕获区域如下所示：
(1)染色体编号chr18、区域起始位置48573407、区域终止位置48604847、区域为外显子区域及外显子内含子交接区域，用于捕获SMAD4基因。
(2)染色体编号chr19、区域起始位置8959598、区域终止位置9091824、区域为外显子区域及外显子内含子交接区域，用于捕获MUC16基因。
(3)染色体编号chr4、区域起...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛维挺，白瑞，胡涵光，蔡文，郑树，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33