一种用于片形吸虫感染检测的标志物及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开一种用于片形吸虫感染检测的标志物、引物和检测试剂盒。本发明专利技术的标志物是血清miRNA生物标志物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。本发明专利技术的片形吸虫病和片形吸虫感染检测试剂盒内包括有引物SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7。本发明专利技术具有组织样本较容易获取，来源方便性能稳定；通过实时定量PCR技术对片形吸虫感染的血清miRNA的检测，结果可信，方便操作。

A marker and kit for the detection of Fasciola flaccida infection

【技术实现步骤摘要】
一种用于片形吸虫感染检测的标志物及试剂盒
本专利技术涉及一种可用于检测寄生虫的标志物、用于制备扩增这一标志物的引物，以及检测试剂盒，特别是一种用于片形吸虫感染检测的标志物、引物和检测试剂盒。
技术介绍
片形吸虫在分类上属于复殖目的片形科片形属吸虫。主要包括肝片形吸虫(Fasciolahepatica)和大片形吸虫(Fasciolagigantica)，是危害牛羊等反刍兽和人类的寄生性蠕虫。其幼虫可寄生于人引发片形吸虫病(fascioliasis)。片形吸虫呈世界性分布，尤其在温带及亚热带地区。我国片形吸虫分布广泛，多呈地区性流行。牛羊等动物感染造成巨大的经济损失，且威胁人类身体健康。目前，对片形吸虫终末宿主感染的检测诊断及流行病学调查主要依赖于粪便检查法和免疫学方法进行生前诊断。粪便检查适用于成虫期诊断，慢性患畜常可检出虫卵，有水洗沉淀法和尼龙筛集卵法。免疫学方法目的在于检测抗体，可用于童虫期诊断，有皮内变态反应、间接血球凝集试验和酶联免疫吸附试验等。该方法具有较高的特异性和敏感性，解决了常规检测方法的一些缺陷如减少污染周围环境及工作人员的危险等，但只能用于终末宿主的检测。对牛、羊的急性型片形吸虫病的诊断，应以解剖检查为主，把肝脏切碎在水中挤压后淘洗，可找到大量童虫。但这种检测方法存在一定的问题：需要捕杀大量的野生动物和操作人员遭受感染和污染周围环境的风险。因此对片形吸虫病宿主感染的早期检测与诊断对片形吸虫病的流行，维护人和动物的公共卫生健康等具有重要作用。
技术实现思路
本专利技术提供一种用于片形吸虫感染检测的标志物、用于制备扩增这一标志物的引物，以及检测试剂盒。本专利技术的标志物是血清miRNA生物标志物，其中之一的序列为SEQIDNo.1，另一种的序列为SEQIDNo.2。本专利技术用于制备SEQIDNo.1的反转录引物，其序列为SEQIDNo.3。本专利技术用于制备SEQIDNo.2的反转录引物，其序列为SEQIDNo.4。本专利技术用于制备SEQIDNo.1的特异引物，其序列为SEQIDNo.5。本专利技术用于制备SEQIDNo.2的特异引物，其序列为SEQIDNo.6。本专利技术用于制备SEQIDNo.1和SEQIDNo.2的通用引物，其序列为SEQIDNo.7。本专利技术的血清miRNA生物标志物序列、所述任一引物均可在制备片形吸虫病和片形吸虫感染检测试剂中应用。本专利技术的片形吸虫病和片形吸虫感染检测试剂盒内包括有引物SEQIDNo.5、SEQIDNo.6和SEQIDNo.7。优选地，本专利技术的片形吸虫病和片形吸虫感染检测试剂盒内还可以有引物SEQIDNo.3和SEQIDNo.4。miRNA是近年来发现的一类新型具有调节基因表达内源性非编码小RNA分子，是潜在的分子诊断和药物靶点。miRNA在血清可长期稳定存在，耐RNA酶降解，反复冻融，长期保存等，因此血清miRNA具备成为一种优异的筛查或诊断的生物标志物的潜质，又拥有以蛋白质为代表的传统生物标志物不具备的特质，即无需抗体制备且易于精确定量，具有良好的开发应用前景。由于血清中的miRNA的表达量较低，寻找一种灵敏度高，操作简便且成本低廉的检测方法是目前血清miRNA应用于寄生虫感染检测亟待解决的问题。而本专利技术较好地解决了这一问题。本专利技术确定的miRNA与片形吸虫感染密切相关，能够作为生物标志物对棘球蚴绦虫感染进行诊断。为今后片形吸虫感染宿主血清miRNA的研究提供了理论依据，并为片形吸虫感染的进行诊断提供了新思路，具有一定的理论意义和潜在的实用价值。本专利技术具有以下技术效果：首先，血清相对其它组织样本较容易获取，来源方便性能稳定。其次，通过实时定量PCR技术对片形吸虫感染的血清miRNA的检测，结果可信，方便操作。附图说明附图1为本专利技术相关操作流程图；附图2为大片形吸虫感染的水牛和未感染的水牛血清中bta-miR-21-5p和bta-miR-23a的相对表达量。具体实施方式本专利技术的片形吸虫感染检测试剂用于检测片形吸虫感染的方法采用加poly(A)尾反转录-实时定量PCR方法，参见附图1，具体步骤如下:1)血清样本采集；2)总RNA提取；3)cDNA反转录；4)实时定量PCR；5)反应结束后由配套的计算机软件计算各反应管内的Ct值比外参Spike-InControl的Ct值做图。以下是通过实例对本专利技术做进一步的阐述。按照“中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物管理及伦理委员会章程”开展动物实验。在实验室进行人工培养大片吸虫囊蚴。将每个小土蜗螺感染3条大片吸虫毛蚴，26℃下饲养感染螺，约33天后收集囊蚴。用含青霉素和链霉素的生理盐水配成含1000个囊蚴/mL悬液。1.血清的收集将购买的24只8–10月龄的水牛随机平均分为感染组和健康对照组。ELISA方法检测显示24头健康水牛血清均为片形吸虫阴性，且粪便检测不到片形吸虫虫卵。同时用三氯苯唑对水牛进行驱虫。两周后每只水牛感染0.5mL囊蚴，健康对照组每只水牛注射0.5mL生理盐水。在感染后28，70，128天分别采血，37℃静置1h后于4℃条件下，以3000r/min离心5min，分离血清，分装后标记，冻存于-80℃冰箱。128天采血后处死，检测水牛的感染状况。2.血清样本总RNA的提取参照Qiagen公司商品化的总RNA提取试剂盒miRNeasySerum/PlasmaKit说明书提取各组血清样本的总RNA，NANODROP2000测量血清RNA的浓度，将提取的RNA置于-80℃保存。具体操作步骤如下：1)取100μL血清置于一个无RNase的1.5mL离心管中，加入500μLQIAzolLysisReagent，上下颠倒混匀，室温静置5min。2)加入100μL的氯仿，上下颠倒混匀15s，室温静置3min。12000×g离心。3)吸取上清于一个新的无RNase离心管，加入1.5倍上清体积的无水乙醇，颠倒混匀。4)取上清700μL加入RNeasyMinElutespincolumn中，室温8000×g离心15s。5)加入700μLbufferRWT洗涤，8000×g离心15s。弃滤液，重复洗涤一次。6)加入500μLBufferRPE洗涤，8000×g离心15s，弃滤液；再加入500μL的80％乙醇洗涤，8000×g离心2min，弃滤液。7)加入15μL的无RNase水，静置5min,8000×g离心1min，即为RNA提取液。3.反转录合成cDNA本专利技术的血清miRNA标志物组合物包括miRNA序列、反转录引物、特异性引物和通用引物序列，如表1所示：表1(利用PolyA聚合酶为成熟的miRNA加上多聚Poly(A)尾，然后采用在5'端具有通用序列的Oligo-dT作为反转录引物，上游引物与miRNA的序列一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种血清miRNA生物标志物，其序列为SEQ ID No.1。/n

【技术特征摘要】
1.一种血清miRNA生物标志物，其序列为SEQIDNo.1。


2.一种血清miRNA生物标志物，其序列为SEQIDNo.2。


3.用于制备SEQIDNo.1的反转录引物，其序列为SEQIDNo.3。


4.用于制备SEQIDNo.2的反转录引物，其序列为SEQIDNo.4。


5.用于制备SEQIDNo.1的特异引物，其序列为SEQIDNo.5。


6.用于制备SEQIDNo.2的特异引物，其序列为SEQIDNo.6。


7.用于制备SEQIDNo.1...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭小腊，郭爱疆，郑亚东，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62