In view of the problems existing in the cultivation of bay scallops at present, the magnetic bead enrichment method was used to screen the microsatellite molecular markers of bay scallops, and the microsatellite markers were used to evaluate the diversity of bay scallops. 20 pairs of microsatellite sequences were designed and obtained Microsatellite primers with effective amplification and polymorphism in the genome of scallops from the Gulf of Mexico. The invention is helpful to understand the genetic characteristics of the bay scallop and provide the related genetic background information and theoretical basis for the improvement of the bay scallop germplasm resources.
【技术实现步骤摘要】
墨西哥湾扇贝微卫星标记的特异引物及其构建方法和应用
本专利技术属于分子生物学DNA标记
,尤其涉及墨西哥湾扇贝微卫星标记的特异引物及其构建方法和应用。
技术介绍
墨西哥湾扇贝原产于美国,主要分布在美国东部大西洋沿岸新泽西州至佛罗里达州之间的海域,由于其双壳比海湾扇贝更加膨凸,出柱率高于海湾扇贝。与海湾扇贝相比,墨西哥湾扇贝具有出肉率高、出柱率高、生长快、适合在中国南方海域养殖等特点。尤其是养殖周期较短,能够避开台风以减少损失,受到业界青睐。至2014年,其养殖面积已超过6600hm2,成为北部湾海域贝类养殖的重要产业。但是墨西哥湾扇贝引种至今已近30年,随着养殖世代的增加,加上近交和瓶颈效应,该品种出现了抗逆性降低、生长速度减慢、个体小型化、死亡率升高等一系列问题,养殖效益严重下滑。微卫星DNA(MicrosatelliteDNA),又称简单重复序列(SimpleSequenceRepeats,SSR),是目前应用最为广泛的分子标记之一,其核心重复序列一般为1-6个碱基,如(CA)n、(GT)n、(CAG)n、(AGCT)n等,首尾相连组成的串联重复序列,长度一般在100bp以内。微卫星标记在家系建立、减少或避免近交衰退,个体识别和亲缘关系鉴定等工作中具有重要作用。申请号为201410750857.5中国专利,其公开了14个管角螺微卫星位点及其引物,所获引物的扩增结果具有高度的多态性和稳定性,用于管角螺的种群遗传多样性检测、个体鉴定或分子辅助育种方法;但是没有给出具体的应用方法和应用结果分析。< ...
【技术保护点】
1.一种墨西哥湾扇贝微卫星标记的特异引物,其特征在于,墨西哥湾扇贝的多态性微卫星位点序号、及用于扩增所述墨西哥湾扇贝微卫星位点的特异引物对包括如下20个中的任一个,其的特征如下:/n
【技术特征摘要】
1.一种墨西哥湾扇贝微卫星标记的特异引物,其特征在于,墨西哥湾扇贝的多态性微卫星位点序号、及用于扩增所述墨西哥湾扇贝微卫星位点的特异引物对包括如下20个中的任一个,其的特征如下:
2.根据权利要求1所述墨西哥湾扇贝微卫星标记的特异引物,其特征在于,所述墨西哥湾扇贝微卫星位点在基因库中对应的编号位置如下:
Locus
GenBankAccessionNo.
AIC1-61
MK158276
AIC5-25
MK158277
AIC2-9
MK158278
AIC1-94
MK158279
AIC2-20
MK158280
AIC5-22
MK158281
AIC3-45
MK158282
AIC4-62
MK158283
AIC3-67
MK158284
AIC4-74
MK158285
AIC4-81
MK158286
AIC5-39
MK158287
AIC5-15
MK158288
AIC4-78
MK158289
AIC5-76
MK158290
AIC5-52
MK158291
AIC2-77
MK158292
AIC1-50
MK158293
AIC3-47
MK158294
AIC5-70
MK158295
3.一种如权利要求1或2所述墨西哥湾扇贝微卫星标记的构建方法,其特征在于,微卫星位点的筛选方法包括如下步骤:
(1)提取墨西哥湾扇贝的基因组DNA;
(2)以步骤(1)所述DNA为模板DNA,将所述模板DNA进行酶切,得到酶切DNA片段;
(3)接头的制备与连接:各取序列为SauA:GATCGTCGGTACCGAATTCT和SauB:GTCAAGAATTCGGTACCGTCGAC的引物,混合置于灭菌PCR管中,将所述PCR管放于PCR仪中进行变性处理,所得即为接头;再利用T4DNA连接酶将所述接头和步骤(2)所得DNA片段连接,得到连接产物;
(4)以连接产物作为模板,以SauA:GATCGTCGGTACCGAATTCT作为引物,进行PCR扩增,得到第一次扩增产物;
(5)以第一次扩增产物为模板DNA,将生物素标记探针、第一次扩增产物混合杂交反应,得到杂交混合液;再将杂交混合液与磁珠充分混合,得到含有微卫星序列的DNA单链片段;
(6)以含有微卫星序列的DNA单链片段作为模板,以SauA:GATCGTCGGTACCGAATTCT作为引物,进行PCR扩增,纯化后得到第二次扩增产物;
(7)将第二次扩增产物进行富集片段的克隆和筛选,然后进行测序,使用软件SSRHunter对测序结果中含有的微卫星核心序列进行查找,使用Primer5.0软件设计引物,引物设计原则:退火温度为55-60℃,引物长度为18-25bp,(G+C)含量为45%-55%;再将选出的引物进行引物合成,得到合成的引物;
(8)以墨西哥湾扇贝DNA为模板,将合成的引物进行退火温度梯度PCR扩增,所得PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测,筛选出能获得清晰条带的引物,并调节PCR反应条件以确定每对引物的最适退火温度;
将所述筛选出能获得清晰条带的引物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,进行群体多态性分析,筛选出20...
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