一种用于检测微卫星不稳定性的组合物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测微卫星不稳定性的组合物及其应用，用于检测微卫星不稳定性的组合物包括分别针对用于检测待检样品中与微卫星不稳定性相关的特异性目的基因的引物对，用于检测微卫星不稳定性的试剂盒采用特异性的多重荧光PCR片段分析毛细管电泳法检测Bat 26、Bat 25、NR‑21、NR‑24、NR‑27、Mono‑27、D5S346、D2S123和D17S250这9个位点和Penta C、Penta D、Amel这3个位点的微卫星分布情况，用于判断微卫星是处于稳定还是不稳定状态。通过调整12对引物的配比、Taq酶的用量、镁离子的用量和PCR体系等，提高整个试剂盒的敏感性和特异性。

A composition for detecting microsatellite instability and its application

The invention discloses a method for detecting the composition and application of microsatellite instability, including composition for detection of microsatellite instability for the sample to be detected and used for the detection of microsatellite instability related specific gene primers for micro satellite distribution situation detection kit using microsatellite instability multiplex fluorescent PCR fragment analysis Bat capillary electrophoresis, Bat 25, NR 26 21, NR 24, NR 27, Mono, D5S346, D2S123 27 and D17S250 9 loci and Penta C, Penta D, Amel these 3 loci, used to determine the micro the satellite is in a stable or unstable state. By adjusting the ratio of 12 pairs of primers, the amount of Taq enzyme, the amount of magnesium ion and PCR system, the sensitivity and specificity of the whole kit were improved.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测微卫星不稳定性的组合物及其应用
本专利技术属于基因检测
，具体涉及一种用于检测微卫星不稳定性的技术。
技术介绍
结直肠癌(ColorectalCancer,CRC)发生的遗传因素包括染色体不稳定性(ChromosomeInstability,CIN)和微卫星不稳定性(MicrosatelliteInstability,MSI)。约80-85％的CRC由CIN引起，包括家族性腺瘤性息肉病(Familialadenomatouspolyposis,FAP)(APC基因胚系突变)和散发性CRC(APC、P53、DCC、KRAS等基因突变)；而另外15-20％的CRC则主要是由MSI引起，包括遗传性非息肉病性结直肠癌(HereditaryNonpolyposisColorectalCancer,HNPCC，又称Lynch综合征)(错配修复基因胚系突变)和散发性MSI(+)CRC(错配修复基因MLH1基因启动子甲基化)。微卫星不稳定(MicrosatalliteInstability，MSI)表现为同一微卫星位点在不同个体之间以及同一个体的正常组织与某些异常组织之间，微卫星位点的重复单位的数目不同。近年来的大量研究表明：MSI与肿瘤发生密切相关，如结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌等。尤其是结直肠癌，临床上已将MSI作为结直肠癌预后和制定辅助治疗方案的重要分子标志物。据文献报道，大约15％的结直肠癌中存在MSI现象，与无MSI的结直肠癌相比，携带有MSI-H的II期结直肠癌患者预后较好，但从5-FU辅助化疗获益较少。Lynch综合征，亦称遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)，是由MMR基因胚系突变所致的显性遗传病。90％以上的Lynch综合征具有MSI特征，而散发性结直肠癌中只有约15％，所以临床上可用MSI检测来进行Lynch综合征的筛查。2015年在新英格兰医学杂志发表的NCT01876511研究结果表明，PD-1单抗治疗对MSI-H的mCRC表现出高缓解率，因此PEMBRO单抗治疗MSI-H的mCRC获得FDA突破性疗法认定。2016年ASCO年会上发布的CheckMate-142，Ⅱ期研究的数据表明，MSI-H的mCRC患者不仅可从PD-1免疫治疗获益，而且对PD-1和CTLA-4联合治疗的临床活性和生存期都远远超过了单独使用PD-1的疗效。2017年5月23日，美国FDA批准了默沙东公司的“明星”PD-1抗体pembrolizumab(商品名：Keytruda)用于治疗携带一种特定基因特征的任何一种实体瘤，具体来说，Keytruda被批准用于治疗携带“MSI-H/dMMR亚型”的成人和儿童实体瘤患者。1997年，NCI推荐使用Bat26、Bat25、D5S346、D2S123和D17S2505个位点检测肿瘤，若其中2个或2个以上位点有改变则为高频率MSI(MSI-H)，有1个位点改变则为低频率MSI(MSI-L)，没有改变则称为微卫星稳定(MSS)。在2002年NCI研讨会中，由于双核苷酸D5S346、D2S123和D17S250位点的灵敏度和特异性检测受限、均低于单核苷酸，修改了MSI检测指南，主要推荐使用更多的单核苷酸进行检测(在双核苷酸不稳定情况下)。目前研究报道，检测的单核苷酸位点有Bat26、Bat25、NR-21、NR-24、NR-27、Mono-27，双核苷酸位点有D5S346、D2S123和D17S250。因此，微卫星不稳定性检测对于结直肠癌预后评价及化疗反应性有重要意义。而目前检测MSI的核苷酸引物及方法敏感性和特异性较低，难以在临床广泛应用。所以探索一种检测微卫星不稳定性快速可靠的核苷酸引物组及方法已经成为临床实验研究的热点问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测微卫星不稳定性的组合物及其应用，通过调整12对引物的配比、Taq酶的用量和镁离子的用量等，将12对引物放置到一管内进行检测，只需检测一次并可同时检测出12个位点的分布情况。进一步通过上述体系的调整，提高整个试剂盒的敏感性和特异性，敏感性和特异性分别能够达到95％和100％，解决了以往检测微卫星不稳定性时敏感性和特异性较低的问题。为了实现上述目的，本专利技术提供的一种用于检测微卫星不稳定性的组合物，所述组合物包括分别针对用于检测待检样品中与微卫星不稳定性相关的特异性目的基因的引物对，包括：NR-21基因正向引物F(NR-21-F)：FAM-GAAGACACATCCCTTT，NR-21基因反向引物R(NR-21-R)：CGCATTCACACTTTC；NR-27基因正向引物F(NR-27-F)：FAM-AGGGGGTGGAGATTGC，NR-27基因反向引物R(NR-27-R)：CATAGGGCAAGCAGAAA；PentaD基因正向引物F(PentaD-F)：FAM-AGTTCCTGTCTCTCTGCCA，PentaD基因反向引物R(PentaD-R)：GCTGTAGCCTTTTGCC；D5S346基因正向引物F(D5S346-F)：FAM-GCAGTTAGTTAGTTAGTT，D5S346基因反向引物R(D5S346-R)：AGTTTATAGCAGATAAGACAG；BAT-25基因正向引物F(BAT-25-F)：HEX-GCAAAGGGCATGGC，BAT-25基因反向引物R(BAT-25-R)：GCTTTTAACTATGGCTCT；BAT-26基因正向引物F(BAT-26-F)：HEX-TCAGCCAGTATATGAAATTG，BAT-26基因反向引物R(BAT-26-R)：AGCTCCTTTCTAAGCCTTCT；PentaC基因正向引物F(PentaC-F)：HEX-AGCAGAGGTTTTCTAAATA，PentaC基因反向引物R(PentaC-R)：AAGTCGTCTTTGGACAGG；D2S123基因正向引物F(D2S123-F)：HEX-GACAAAAACAGGATGCCT，D2S123基因反向引物R(D2S123-R)：GGGACTTTCCACCTATGGGAC；MONO-27基因正向引物F(MONO-27-F)：TMR-GTGGGAGACAGAGCA，MONO-27基因反向引物R(MONO-27-R)：TGGCCAACTAAAAAAGAA；NR-24基因正向引物F(NR-24-F)：TMR-AATTTTACCTCCTGACTCCAA，NR-24基因反向引物R(NR-24-R)：CAACCTGGGTGACAGAGT；Amel基因正向引物F(Amel-F)：TMR-GGCGCGCGACACCGCAG，Amel基因反向引物R(Amel-R)：CCCTTTCTCAAGGGAACC；D17S250基因正向引物F(D17S250-F)：TMR-CATACATAAACTTTCAAAT，D17S250基因反向引物R(D17S250-R)：GGTTTAAATATATATATGGC。优选地，对NR-21基因、NR-27基因、PentaD基因和D5S346基因的正向引物的5’端进行FAM修饰；对BAT-25基因、BAT-26基因、PentaC基因和D2S123基因的正向引物的5’端进行HEX修饰；对M本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测微卫星不稳定性的组合物，其特征在于，所述组合物包括分别针对用于检测待检样品中与微卫星不稳定性相关的特异性目的基因的引物对，包括：NR‑21基因正向引物F(NR‑21‑F)：SEQ ID NO.1，NR‑21基因反向引物R(NR‑21‑R)：SEQ ID NO.2；NR‑27基因正向引物F(NR‑27‑F)：SEQ ID NO.3，NR‑27基因反向引物R(NR‑27‑R)：SEQ ID NO.4；Penta D基因正向引物F(Penta D‑F)：SEQ ID NO.5，Penta D基因反向引物R(Penta D‑R)：SEQ ID NO.6；D5S346基因正向引物F(D5S346‑F)：SEQ ID NO.7，D5S346基因反向引物R(D5S346‑R)：SEQ ID NO.8；BAT‑25基因正向引物F(BAT‑25‑F)：SEQ ID NO.9，BAT‑25基因反向引物R(BAT‑25‑R)：SEQ ID NO.10；BAT‑26基因正向引物F(BAT‑26‑F)：SEQ ID NO.11，BAT‑26基因反向引物R(BAT‑26‑R)：SEQ ID NO.12；Penta C基因正向引物F(Penta C‑F)：SEQ ID NO.13，Penta C基因反向引物R(Penta C‑R)：SEQ ID NO.14；D2S123基因正向引物F(D2S123‑F)：SEQ ID NO.15，D2S123基因反向引物R(D2S123‑R)：SEQ ID NO.16；MONO‑27基因正向引物F(MONO‑27‑F)：SEQ ID NO.17，MONO‑27基因反向引物R(MONO‑27‑R)：SEQ ID NO.18；NR‑24基因正向引物F(NR‑24‑F)：SEQ ID NO.19，NR‑24基因反向引物R(NR‑24‑R)：SEQ ID NO.20；Amel基因正向引物F(Amel‑F)：SEQ ID NO.21，Amel基因反向引物R(Amel‑R)：SEQ ID NO.22；D17S250基因正向引物F(D17S250‑F)：SEQ ID NO.23，D17S250基因反向引物R(D17S250‑R)：SEQ ID NO.24。...

【技术特征摘要】
1.一种用于检测微卫星不稳定性的组合物，其特征在于，所述组合物包括分别针对用于检测待检样品中与微卫星不稳定性相关的特异性目的基因的引物对，包括：NR-21基因正向引物F(NR-21-F)：SEQIDNO.1，NR-21基因反向引物R(NR-21-R)：SEQIDNO.2；NR-27基因正向引物F(NR-27-F)：SEQIDNO.3，NR-27基因反向引物R(NR-27-R)：SEQIDNO.4；PentaD基因正向引物F(PentaD-F)：SEQIDNO.5，PentaD基因反向引物R(PentaD-R)：SEQIDNO.6；D5S346基因正向引物F(D5S346-F)：SEQIDNO.7，D5S346基因反向引物R(D5S346-R)：SEQIDNO.8；BAT-25基因正向引物F(BAT-25-F)：SEQIDNO.9，BAT-25基因反向引物R(BAT-25-R)：SEQIDNO.10；BAT-26基因正向引物F(BAT-26-F)：SEQIDNO.11，BAT-26基因反向引物R(BAT-26-R)：SEQIDNO.12；PentaC基因正向引物F(PentaC-F)：SEQIDNO.13，PentaC基因反向引物R(PentaC-R)：SEQIDNO.14；D2S123基因正向引物F(D2S123-F)：SEQIDNO.15，D2S123基因反向引物R(D2S123-R)：SEQIDNO.16；MONO-27基因正向引物F(MONO-27-F)：SEQIDNO.17，MONO-27基因反向引物R(MONO-27-R)：SEQIDNO.18；NR-24基因正向引物F(NR-24-F)：SEQIDNO.19，NR-24基因反向引物R(NR-24-R)：SEQIDNO.20；Amel基因正向引物F(Amel-F)：SEQIDNO.21，Amel基因反向引物R(Amel-R)：SEQIDNO.22；D17S250基因正向引物F(D17S250-F)：SEQIDNO.23，D17S250基因反向引物R(D17S250-R)：SEQIDNO.24。2.根据权利要求1所述的用于检测微卫星不稳定性的组合物，其特征在于，对NR-21基因、NR-27基因、PentaD基因和D5S346基因的正向引物的5’端进行FAM修饰；对BAT-25基因、BAT-26基因、PentaC基因和D2S123基因的正向引物的5’端进行HEX修饰；对MONO-27基因、NR-24基因、Amel基因和D17S250基因的正向引物的5’端进行TMR修饰；实现一管内多重荧光位点的检测。3.根据权利要求1所述的用于检测微卫星不稳定性的组合物，其特征在于，进行一次检测时，NR...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘沛，王林海，
申请(专利权)人：北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11