检测人EGFR基因21L858R点突变的智能恒温扩增引物组、检测试剂盒及方法技术

一种检测人EGFR基因外显子21L858R点突变的智能恒温扩增检测引物组、检测试剂盒及方法。引物组包括TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物；检测试剂盒包括引物液、反应液、Bst DNA聚合酶、错配结合蛋白、显色剂和对照。检测方法是利用具有链置换活性的DNA聚合酶，采用四条特异性引物及一种错配结合蛋白，在63℃对样品DNA模板进行扩增，可检测到DNA的pg级，其鉴定方式是将扩增产物加入

Intelligent constant temperature amplification primer set, detection kit and method for detecting 21L858R point mutation of human EGFR gene

Intelligent constant temperature amplification detection primer set, detection kit and method for detecting 21L858R point mutation of human EGFR gene exon. A primer set including TP primers and FP primer and BP primer and OP1 primer and OP2 primer; primer kit including liquid, Bst reaction liquid, DNA polymerase, mismatch binding protein, chromogenic agent and control. The detection method is the use of DNA polymerase with chain displacement activity, using four specific primers and a mismatch binding protein, 63 degrees in the sample DNA templates were amplified by PG DNA can be detected, the identification of the amplified products is added

【技术实现步骤摘要】
检测人EGFR基因21L858R点突变的智能恒温扩增引物组、检测试剂盒及方法
本专利技术属于分子生物学
，涉及一种基于智能恒温扩增技术检测人EGFR基因21L858R点突变的引物组、试剂盒及方法。
技术介绍
近年来，非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)的发病率逐年增高，严重威胁着人类的健康。表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制剂改变了NSCLC患者的治疗策略。EGFR突变是该类药物的预测因子，在NSCLC的治疗决策中起重要作用。人表皮生长因子受体(EGFR)基因外显子21L858R发生突变的非小细胞肺癌患者，对酪氨酸激酶抑制剂类药物敏感，即受体酪氨酸激酶抑制剂药物对这些患者有疗效。外显子21上的L858R点突变通常是替代突变，2573位的T由G取代，导致EGFR第858位框架氨基酸由亮氨酸变为精氨酸(CTG—CGG)。因此EGFR外显子21L858R点突变的检测，可以为筛选靶向治疗患者提供参考；同时可用于癌症患者，特别是肺癌患者的高灵敏度早期复发监测，以及用药期间耐药性突变监测。随着分子生物学的发展，出现了众多以分子生物学技术为基础的EGFR突变检测方法，如荧光定量PCR、DNA探针、DNA芯片、DNA直接测序等，以其高效、特异等优点而受到青睐；但这些检测技术对检测人员技术水平要求高，并且这些技术需要的检测仪器昂贵、检测周期长，难以实现快速检测和临床推广的目的。所以，在临床检测和科学研究实践中均需要一种降低操作技术和费用、快速简便、容易普及、安全可靠的检测方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术所解决的技术问题在于提供一种检测人EGFR基因21L858R点突变的智能恒温扩增引物组。本专利技术所解决的技术问题还在于提供一种检测人EGFR基因21L858R点突变智能恒温扩增检测试剂盒。本专利技术所解决的技术问题还在于提供一种检测人EGFR基因21L858R点突变的智能恒温扩增检测方法。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：一方面，本专利技术公开了一种检测人EGFR基因21L858R点突变的智能恒温扩增检测引物组，包括TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物，其核苷酸序列分别如下所示：TP引物：CCTATCGGCATAGGATCACAGATTTGGGCG；FP引物：GCTGGGTGCGCTCCTTACTTTGCCTCCTTC；BP引物：AAGAGAAAGAATACCATGC；OP1引物：AAACACCGCAGCATGTC；OP2引物：CTGGCTGACCTAAAGCC。优选地，扩增反应时，TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物的摩尔比为：8：8：4：1：1。另一方面，本专利技术还公开了一种检测人EGFR基因21L858R点突变的智能恒温扩增检测试剂盒，该检测试剂盒中含有上述方案中所列的智能恒温扩增引物组。优选地，该智能恒温扩增检测试剂盒还包括以下成分的部分或者全部：(1)DNA聚合酶；(2)错配结合蛋白；(3)智能恒温扩增反应液；(4)荧光显色剂；(5)阳性对照和阴性对照。优选地，该智能恒温扩增检测试剂盒中，其引物中TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物的摩尔比为：8：8：4：1：1。优选地，所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶；所述错配结合蛋白为TapMuts错配结合蛋白。优选地，所述智能恒温扩增反应液含有：28mMdNTPs、10％DMSO、40mMTris-HCl(pH8.8)、20mMKCl、20mM(NH4)2SO4、16mMMgSO4，0.2％20。优选地，阳性对照为含有检测人EGFR基因外显子21L858R突变点基因片段的T载体克隆，阴性对照为不含人EGFR基因外显子21L858R突变点基因片段的水或其他溶剂。更优地，阴性对照为去离子水。优选地，所述显色剂为1/50000原液稀释的GreenI。再有，本专利技术还公开了一种检测人EGFR基因21L858R点突变的智能恒温扩增检测方法，包括如下步骤：(1)待检样品DNA的提取；(2)智能恒温扩增反应：将步骤(1)中提取的待检样品DNA加入智能恒温扩增反应体系中，混匀后离心，并于63℃反应40min；该智能恒温扩增反应体系中含有上述方案中所述的智能恒温扩增引物组；(3)结果判断：通过观察ESE-tubescanner扩增仪的扩增曲线判断扩增结果。优选地，所用智能恒温扩增反应的体系为：25μL反应体系中含有TP和EP引物各1.6μmol/L、BP引物0.8μmol/L、OP1和OP2引物各0.5μmol/L、dNTP0.5mmol/L、甜菜碱0.6mol/L、(NH4)2SO4mmol/L、MgCl22.5mmol/L、KCl10mmol/L、MgSO42mmol/L、GreenI0.5μL、pH为8.8的Tris-HCl20mmol/L、0.2％20、6UBstDNA聚合酶、1μgTapMuts、1μLDNA步骤(1)中提取的待检样品DNA，用去离子水补齐到25μL。本专利技术的检测人EGFR基因21L858R点突变的智能恒温扩增检测方法可以通过本专利技术方案中的所公开的智能恒温扩增检测试剂盒得以实施，也可以采用基于本专利技术的原理和设计思路采用其他类似智能恒温扩增检测试剂盒得以实现。从原理上讲，本专利技术以智能恒温扩增技术为依托，开发一种可快速检测出人EGFR基因21L858R点突变的引物组、试剂盒和方法，智能恒温扩增法(Smartamplificationprocess)是一种基于链置换酶和DNA错配修复蛋白的基因突变检测体系。智能恒温扩增技术的基本原理，即获取目标序列后在等温条件下对其反复进行扩增，并通过荧光实时监测，以检测目标序列的存在。因此，结合上述原理及本专利技术实施例中的技术效果可知，本专利技术至少包含如下有益效果：本专利技术所设计的5条引物中，TP由退火序列和一段能够与目标序列互补的核苷酸序列构成，FP带有一个茎环结构，他们的退火位点分别位于目标序列的两端，可分别从两端与互补的2条DNA单链退火，向对侧延伸。OP1和OP2的退火位点分别位于TP和FP外侧，向中间退火延伸的同时将TP和FP延伸得到的双链剥离。带有TP或FP的单链被置换下来后又可作为模板，继续上述过程，如此可形成2种关键的单链中间产物，这2种中间产物继而分别以TP和FP的特殊结构为起点，进行自身引导的DNA合成。这样循环往复，在DNA聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，实现目标序列的大量扩增。在此过程中，其中一条引物上结合一种杂交敏感的荧光引物，一旦与互补序列退火杂交，即可发出一定强度的荧光，然后由成本低廉的恒温扩增仪(如ESE-Tubescanner)进行检测。随着扩增反应的进行，荧光强度增大，当超过检测最低I值时即可确定扩增反应的实现，也即目标序列的存在。整个过程在恒温条件下30-40min即可完成。智能恒温扩增技术具有独特的错配抑制技术，能够识别单个核苷酸的差异，成为单核苷酸多态性检测的有力方法。这也是与其他等温扩增技术，如环介导恒温扩增、链置换扩增、核酸序列扩增、转录酶扩增、滚环扩增、解链酶扩增等相比，智能恒温扩增最为明显的优点，这些传统的恒温扩本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测人EGFR基因21L858R点突变的智能恒温扩增引物组，包括TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物，其核苷酸序列分别如下所示：TP引物：CCTATCGGCATAGGATCACAGATTTGGGCG；FP引物：GCTGGGTGCGCTCCTTACTTTGCCTCCTTC；BP引物：AAGAGAAAGAATACCATGC；OP1引物：AAACACCGCAGCATGTC；OP2引物：CTGGCTGACCTAAAGCC。

【技术特征摘要】
1.一种检测人EGFR基因21L858R点突变的智能恒温扩增引物组，包括TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物，其核苷酸序列分别如下所示：TP引物：CCTATCGGCATAGGATCACAGATTTGGGCG；FP引物：GCTGGGTGCGCTCCTTACTTTGCCTCCTTC；BP引物：AAGAGAAAGAATACCATGC；OP1引物：AAACACCGCAGCATGTC；OP2引物：CTGGCTGACCTAAAGCC。2.如权利要求1所述的检测人EGFR基因21L858R点突变的智能恒温扩增引物组，其特征在于：扩增反应时，TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物的摩尔比为：8：8：4：1：1。3.一种检测人EGFR基因21L858R点突变的智能恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒中含有如权利要求1或2所述的智能恒温扩增引物组。4.根据权利要求3所述的检测人EGFR基因21L858R点突变的智能恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，还包括以下成分的部分或者全部：(1)DNA聚合酶；(2)错配结合蛋白；(3)智能恒温扩增反应液；(4)荧光显色剂；(5)阳性对照和阴性对照。5.根据权利要求4所述的检测人EGFR基因21L858R点突变的智能恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶；所述错配结合蛋白为TapMuts错配结合蛋白。6.根据权利要求4所述的检测人EGFR基因21L858R点突变的智能恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述智能恒温扩增反应液含有：28mMdNTPs、10％DMSO、40mMTris-HCl(pH8.8)、20mMKCl、20mM(NH4)2SO4、16m...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶蕾，刘雪美，闫鹤，石磊，陈洵，常彦磊，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44