多重荧光定量检测新生隐球菌和曲霉菌的试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了多重荧光定量检测新生隐球菌和曲霉菌的试剂盒和方法。本发明专利技术提供了检测新生隐球菌和曲霉菌多重荧光定量试剂，包括检测新生隐球菌的引物1、检测新生隐球菌的引物2、检测新生隐球菌的探针1、检测曲霉菌的引物3、检测曲霉菌的引物4和检测曲霉菌的探针2。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术的试剂盒和检测方法基于多重的Taqman荧光定量检测技术，不仅可以快速明确含有的病原体，减少检测费用，提高仪器使用率，而且解决了临床呼吸道真菌含有病原体检测的通量问题，对临床的早期诊断和治疗具有重要的指导意义。

Kits and methods for multiplex fluorescence quantitative detection of Cryptococcus neoformans and Aspergillus spp.

The invention discloses a kit and a method for multiplex fluorescence quantitative detection of Cryptococcus neoformans and aspergillus. The present invention provides detection of Cryptococcus neoformans and Aspergillus multiple quantitative fluorescent reagent probe primers including detection of Cryptococcus neoformans were 1, 2, detection of Cryptococcus neoformans detection of Cryptococcus neoformans 1, detection of Aspergillus Aspergillus detection primer 3 and primer 4 and detection of Aspergillus 2. The test kit and the detection method based on Taqman fluorescence quantitative detection technology of multiple, not only can quickly clear with pathogens, reduce testing costs, improve equipment utilization, but also solves the problem of pathogenic fungi with clinical respiratory flux measuring, and has important guiding significance for the early diagnosis and treatment clinical.

【技术实现步骤摘要】
多重荧光定量检测新生隐球菌和曲霉菌的试剂盒和方法
本专利技术属于核酸检测
，尤其涉及多重荧光定量检测新生隐球菌和曲霉菌的试剂盒和方法。
技术介绍
侵袭性真菌含有主要的致病真菌有念珠菌属、曲霉属、隐球菌属等条件致病真菌，还有组织胞浆菌、皮炎芽生菌、孢子丝菌等地方流行性致病真菌。不同环境下，含有的真菌种类不同。侵袭性真菌含有早期没有特异性表现，所以很容易被掩盖，病死率很高。新型隐球菌(CryptococcusNeoformans，CN)是一种可引起人类严重含有的酵母样病原真菌，主要引起细胞免疫功能低下者，如器官移植、肺癌患者及艾滋病(AIDS)患者并发隐球菌病。曲霉菌包括132个种和18个变种，临床上常见的有烟曲霉(A.fumigatus)，黄曲霉(A.flavus)，黑曲霉(A.niger)，杂色曲霉(A.versicolor)和构巢曲霉(A.nidulans)等。其中烟曲霉存在于谷物、污染的食品、土壤和霉腐物中，是引起人和动物曲霉病的重要病原菌。含有肺部和其他器官，也能引起敏症。烟曲霉可寄生于肺内，发生肺结核样症状，是肺曲霉病的主要病原菌，还可产生烟曲霉毒素。黑曲霉能引起曲霉菌病，还能产生黑曲霉毒素。黄曲霉可引起肺、外耳道、皮肤脓皮病样曲霉病等，有些菌系可产生黄曲霉毒素，引起中毒或致癌。目前市面上关于曲霉菌的实时荧光定量检测试剂盒寥寥无几，关于新生隐球菌和曲霉菌双重检测的试剂盒几乎没有。临床上，特别是肺癌患者免疫力低下的情况，经常伴随着新生隐球菌和曲霉菌双重真菌含有。所以研发多重荧光定量PCR同时检测新生隐球菌和曲霉菌的试剂盒及方法显便具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术一个目的是提供检测新生隐球菌和曲霉菌多重荧光定量试剂。本专利技术提供的试剂，包括检测新生隐球菌的引物1、检测新生隐球菌的引物2、检测新生隐球菌的探针1、检测曲霉菌的引物3、检测曲霉菌的引物4和检测曲霉菌的探针2；所述引物1的核苷酸序列为序列2；所述引物2的核苷酸序列为序列3；所述探针1的核苷酸序列为序列4；所述引物3的核苷酸序列为序列6；所述引物4的核苷酸序列为序列7；所述探针2的核苷酸序列为序列8。上述试剂还包括内标荧光探针3，所述内标荧光探针3的核苷酸序列为序列10。上述试剂中，所述各个探针的两端分别标记荧光基团和淬灭基团。上述试剂中，所述引物1、所述引物2、所述探针1、所述引物3、所述引物4、所述探针2和所述探针3的摩尔比为2:2:1:2:2:1:1。本专利技术的另一个目的是提供检测新生隐球菌和曲霉菌多重荧光定量PCR试剂。本专利技术提供的PCR试剂，包括上述试剂；所述各引物在所述PCR试剂中的浓度为0.4uM；所述各探针在所述PCR试剂中的浓度为0.2uM。含有上述试剂或所述PCR试剂的试剂盒也是本专利技术保护的范围。试剂盒中还可以包括新生隐球菌IGS-1基因序列的标准品、曲霉菌ITS-1基因序列的标准品、内标、阳性对照品和阴性对照品。新生隐球菌IGS-1基因序列的标准品为将序列1所示的新生隐球菌IGS-1基因特异序列与pGEM-T载体连接，得到新生隐球菌质粒，即为标准品。曲霉菌IGS-1基因序列的标准品为将序列5所示的新生隐球菌IGS-1基因特异序列与pGEM-T载体连接，得到曲霉菌质粒，即为标准品。内标：为将序列9所示的内标序列与pGEM-T载体(Promega，产品编号A362A)连接，得到内标质粒，即为标准品。阳性对照品为灭活的新生隐球菌、烟曲霉菌、黑曲霉菌和黄曲霉的DNA提取物的混合物(按3：1：1：1质量比混合)。阴性对照品为正常人的痰液提取液。上述试剂或上述PCR试剂或上述的试剂盒在检测或定量检测新生隐球菌和/或曲霉菌中的应用也是本专利技术保护的范围；或上述试剂或上述PCR试剂或上述的试剂盒在制备检测或定量检测新生隐球菌和/或曲霉菌产品中的应用也是本专利技术保护的范围；或上述试剂或上述PCR试剂或上述的试剂盒在制备检测待测样本是否含有新生隐球菌和/或曲霉菌产品中的应用也是本专利技术保护的范围。若要定量检测，可以通过检测5个浓度梯度定量参考品(标准品)的Ct值大小，并用该5个浓度梯度定量参考品(标准品)的Ct值大小和5个浓度梯度绘制的标准曲线，将待测样本的ct值带入该标准曲线中，得到待测样本的定量检测结果；本专利技术第3个目的是提供一种检测待测样本是否含有新生隐球菌和/或曲霉菌的方法，包括如下步骤：用权利要求5所述PCR试剂对待测样本进行实时荧光定量PCR，若所述待测样本的实时荧光定量PCR结果为如下条件1：在测定新生隐球菌的通道下扩增曲线呈S型或Ct值≤44且Ct值＞0，则所述待测样本含有或候选含有新生隐球菌；若所述待测样本的实时荧光定量PCR结果不为所述条件1，则所述待测样本不含有或候选不含有新生隐球菌；和/或，若所述待测样本的实时荧光定量PCR结果为如下条件2：在测定曲霉菌的通道下扩增曲线呈S型或Ct值≤44且Ct值＞0，则所述待测样本含有或候选含有曲霉菌；若所述待测样本的实时荧光定量PCR结果不为所述条件2，则所述待测样本不含有或候选不含有曲霉菌。上述方法中，所述PCR扩增的模板为待测样本的DNA，所述PCR扩增的方法还可以将待测样本的DNA和内标混合作为模板。内标：为将序列9所示的内标序列与pGEM-T载体(Promega，产品编号A362A)连接，得到内标质粒，即为标准品。本专利技术中可以设置的参照物包括：新生隐球菌工作标准品对照、曲霉菌工作标准品对照、阳性对照、阴性对照、内标。其中内标作为靶标核酸的竞争性内标，可以作为参照物，用于防止假阴性结果的发生，通过检测加入有内标的样本，可了解整个扩增反应体系是否受抑制，更好的提示假阴性。本专利技术的实验证明，本专利技术的试剂盒和检测方法基于多重的Taqman荧光定量检测技术，不仅可以快速明确含有的病原体，减少检测费用，提高仪器使用率，而且解决了临床呼吸道真菌含有病原体检测的通量问题，对临床的早期诊断和治疗具有重要的指导意义。附图说明图1为本专利技术特异性实验结果图。图2为本专利技术灵敏度试验结果图。图3为本专利技术临床样品评估实验结果图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、新生隐球菌和曲霉菌多重实时荧光定量检测试剂盒及其专用引物一、新生隐球菌和曲霉菌多重实时荧光定量检测专用引物的设计与合成根据新生隐球菌IGS-1基因特异序列(序列1)设计引物序列如下：新生隐球菌上游扩增引物序列为：5'-GTCTCTAACATGTTGGGTCTCG-3'(序列2)；新生隐球菌下游扩增引物序列为5'-TCCTAGAGTCATCCACACTTCA-3'(序列3)；新生隐球菌荧光探针序列为：5'-CCCTTACATCCAAGTCTCTAGAGGAAGCC-3'(序列4)，其5'端标记FAM荧光基团，3’端标记TAMRA淬灭基团。根据曲霉菌ITS-1基因特异序列(序列5)设计引物序列如下：曲霉菌上游扩增引物：5'-ACAATGGATCTCTTGGTTCCG-3'(序列6)；曲霉菌下游扩增引物：5'-GCGCAATGTGCGTTCAAA-3'(序列7)；曲霉菌荧光探针序列为：5'-CGATGAAGAACGCAGCGAAATG本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测新生隐球菌和曲霉菌多重荧光定量试剂，包括检测新生隐球菌的引物1、检测新生隐球菌的引物2、检测新生隐球菌的探针1、检测曲霉菌的引物3、检测曲霉菌的引物4和检测曲霉菌的探针2；所述引物1的核苷酸序列为序列2；所述引物2的核苷酸序列为序列3；所述探针1的核苷酸序列为序列4；所述引物3的核苷酸序列为序列6；所述引物4的核苷酸序列为序列7；所述探针2的核苷酸序列为序列8。

【技术特征摘要】
1.检测新生隐球菌和曲霉菌多重荧光定量试剂，包括检测新生隐球菌的引物1、检测新生隐球菌的引物2、检测新生隐球菌的探针1、检测曲霉菌的引物3、检测曲霉菌的引物4和检测曲霉菌的探针2；所述引物1的核苷酸序列为序列2；所述引物2的核苷酸序列为序列3；所述探针1的核苷酸序列为序列4；所述引物3的核苷酸序列为序列6；所述引物4的核苷酸序列为序列7；所述探针2的核苷酸序列为序列8。2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：所述试剂还包括内标荧光探针3，所述内标荧光探针3的核苷酸序列为序列10。3.根据权利要求1或2所述的试剂，其特征在于：所述各个探针的两端分别标记荧光基团和淬灭基团。4.根据权利要求1-3中任一所述的试剂，其特征在于：所述引物1、所述引物2、所述探针1、所述引物3、所述引物4、所述探针2和所述探针3的摩尔比为2:2:1:2:2:1:1。5.检测新生隐球菌和曲霉菌多重荧光定量PCR试剂，包括权利要求1-4中任一所述试剂；所述各引物在所述PCR试剂中的浓度为0.4uM；所述各探针在所述PCR试剂中的浓度为0.2uM。6.含有权利要求1-4中任一所述试剂或权利要求5所述PCR试剂的试剂盒。7.权利要求1-4中任一所述试剂或权利要求5所述PCR试剂或权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔阳，余倩，葛猛，王宏伟，
申请(专利权)人：北京福安华生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11