一种人类线粒体全长单倍型测定及遗传变异分析方法技术

本发明专利技术公开了一种人类线粒体全长单倍型测定及遗传变异分析方法，该方法主要是通过引物扩增一次性获得人类线粒体基因组的模板，然后通过SMRT测序技术获得线粒体全长序列，再将获得的序列进行生物信息学分析，从而得到变异信息。本发明专利技术基于SMRT测序技术的优势，不仅可以对获得的人类线粒体基因组的线粒体全长单倍型进行测定，并且通过序列多态性等分析，可以获得更多更有价值的线粒体遗传变异信息，对应用于人类疾病作出准确的病因诊断方面具有重要的意义。因此，本发明专利技术的方法可适用于人类所有线粒体相关疾病DNA全长单倍型的测定需求和法医学研究应用中对线粒体全长单倍型测定的需求。

A human mitochondrial haplotype analysis and genetic variation analysis

The invention discloses a method for measuring the full-length human mitochondrial haplotype and genetic variation analysis method, this method is mainly through the amplification of a one-time gain of the human mitochondrial genome template, and then get the full-length sequence of mitochondrial SMRT by sequencing, then the sequence by bioinformatic analysis, so as to obtain the variation information. The invention of SMRT sequencing technology based on the advantages of not only the human mitochondrial genome of mitochondrial haplotype length were measured, and through the analysis of sequence polymorphism, mitochondrial genetic variation can get more valuable, make diagnosis accurate on the application in human diseases has important significance. Therefore, the present method can be applied to the determination of the full length haplotype of all mitochondrial related diseases in human DNA and the need for full length haplotype determination in forensic studies.

【技术实现步骤摘要】
一种人类线粒体全长单倍型测定及遗传变异分析方法
：本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种获得人类线粒体基因组以及线粒体全长单倍型的测定和变异分析的方法。
技术介绍
：线粒体是细胞内的能量工厂，它具有自身的一套DNA(mtDNA)，通过母亲的卵子传递给下一代。除了红血细胞外，其存在于人体内的每一个细胞中，线粒体的主要功能是提供细胞所需要的能量-三磷酸核苷酸(ATP)。人线粒体DNA(mtDNA)，共包含37个基因，这37个基因中有22个编码转移核糖核酸(tRNA)、2个编码核糖体核糖核酸(12S和16SrRNA)，13个编码多肽。线粒体与许多人类疾病相关，线粒体疾病的发生是由于线粒体的功能不正常而导致的一些疾病，发生在卵子中的线粒体突变可能引起母系家族性疾病。这种突变会导致严重的问题，受影响的大多数是能量需求高的器官，例如肌肉、大脑、心脏，涉及到一系列广泛的母源性遗传病线粒体疾病，目前临床只能选择少数常见的线粒体基因位点进行突变和缺失筛查，阳性率很低，大多数患者难以获得准确的病因诊断。线粒体不仅仅与许多人类疾病息息相关，而且在人类母系起源研究、法医学、考古学等方面研究都具有重要的影响。为了获得更多更有价值的信息，能否利用线粒体全基因组单倍型信息是一个重要环节。传统的方法是将线粒体基因组一小段、一小段的进行扩增，然后拼接测序，一代测序过程中需要几十对引物，相对费时费力，二代测序需要用大量的小片段进行拼接，而线粒体基因组中存在假基因、大片段缺失或大片段重复用时，用二代测序更无法进行准确的拼接。为此，申请人提出一种依托SMRT测序技术对人类线粒体全长单倍型信息进行测定，建立线粒体全基因组变异分析的方法。
技术实现思路
：本专利技术的目的旨在提供一种基于SMRT测序技术获得人类线粒体基因组以及线粒体全长单倍型的测定和变异分析的方法。本专利技术的方法主要是通过引物扩增一次性获得人类线粒体基因组的模板，然后通过SMRT测序技术获得线粒体全长序列，再将获得的序列进行生物信息学分析，从而得到变异信息。为实现上述目的，本专利技术采取以下技术方案：一种人类线粒体全长单倍型测定及遗传变异分析方法，具体包括如下步骤：1)提取人线粒体全基因组DNA；2)通过一对引物进行PCR扩增获得线粒体全基因组DNA模板，即PCR产物；3)将获得的所有PCR产物均匀混合形成DNA池；4)将DNA池通过SMRT测序技术构建成20K文库后，于PacBioRSⅡ测序仪上进行测序及序列多态性分析，即可获得线粒体遗传变异信息。上述PCR扩增的引物为：正向引物序列为：5’-GTACCCTAACCCGTGCAAAGGTAGCATA-3’，反向引物为：5’-ACAGGTCCCTATTTAAGGAACAAGTGAT-3’。本专利技术的有益效果在于：本专利技术基于SMRT测序技术具有读长长(可达16k以上)、测序结果无系统性误差、可以克服重复序列和高GC含量序列等优势，不仅可以对获得的人类线粒体基因组的线粒体全长单倍型进行测定，并且通过序列多态性等分析，可以获得更多更有价值的线粒体遗传变异信息，对应用于人类疾病作出准确的病因诊断方面具有重要的意义。因此，本专利技术的方法可适用于人类所有线粒体相关疾病DNA全长单倍型的测定需求和法医学研究应用中对线粒体全长单倍型测定的需求。附图说明：图1是本专利技术实施例1中PCR扩增产物的电泳图；图2是本专利技术实施例1中序列分析保存的序列对齐比对图。具体实施方式：下面结合附图和具体实施例对本专利技术的技术方案进行详细说明。实施例1按照Qiagen全基因组核酸提取试剂盒使用说明，对外周血样本提取基因组DNA；总共采集15个不同人的外周血样品。1.外周血样本DNA的提取：1)按样本编号排好EP离心管，并标记；2)向每个1.5ml的EP管中加入PK酶溶液20ul，然后分别加入外周血样本200ul；3)向每个EP管中加入蛋白酶K液200ul，盖好EP管盖，在漩涡振荡器上振荡15秒，随后瞬时离心；4)将各EP管放入悬浮泡沫孔中，置于56℃水浴箱中10-30min，期间可适当翻转；5)取出各离心管，瞬时离心后，向各管中加入无水乙醇200ul，振荡混匀15秒，瞬时离心；6)将EP管中的酶解混合物转移至Q柱上，8000rpm，离心1min；7)换废液收集管，加AW1液500ul，8000rpm，离心1min；8)换废液收集管，加AW2液500ul，13000rpm，离心3min；9)将Q柱转移至新标记好的1.5ml离心管中，加入60ulAE液，室温静置10min后，8000rpm，离心1min；10)丢弃Q柱，将DNA留置于EP管中。2.PCR扩增：扩增的引物为：正向引物序列：5’-GTACCCTAACCCGTGCAAAGGTAGCATA-3’，反向引物为：5’-ACAGGTCCCTATTTAAGGAACAAGTGAT-3’；其中：引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成，Taq酶由ThermoScientific提供。PCR扩增程序为：94℃2min，10cycles(94℃10s，68℃17min)，25cycles(94℃10s，68℃17min)，72℃5min，4℃保存。PCR反应体系如下：如图1所示，为本实施例的PCR扩增产物的电泳图。3.建库测序：将15份PCR产物均匀稀释至200ng/ul，然后从每份稀释后的PCR产物取10ul，在一个1.5ml的EP管中均匀混合形成DNA池，然后按照PacBioRSⅡ的标准流程构建20K文库，上样在一个cell中，然后在PacBioRSⅡ测序仪上进行测序。4.序列分析：1)对PacBioRSⅡ测序仪产生的原始序列数据在SMRTanalysis2.3上进行校正，输出校正后序列，其中序列原始状况如下：测序结果的原始状况，其中：ReadsOfInsert是完成测序的拷贝数，ReadBasesofInsert是测序的总碱基数，MeanReadLengthofInsert是平均插入读长，MeanReadQualityofInsert是插入片段平均测序精度，MeanNumberofPass是测序深度；2)将校正后的序列输入MEGA7软件进行比对，将对齐后的序列文件以fas格式保存，如图2所示，为保存的序列对齐比对图(仅为部分截图)；3)将fas格式的序列文件输入DNAspV5软件，输入之前确保序列中无非法字符，如“N,R”等；4)对其后的文件中序列进行序列多态性分析，结果如下：序列长度：16570总的多态性位点数：175序列的不同单倍型数：13单倍型多样度：0.989核苷酸多样度：0.00246。以上所述的实施例仅为本专利技术的一个优选实施例，其并不能将本专利技术的技术方案限制或约束在人类线粒体相关疾病DNA全长单倍型的测定及遗传变异分析的应用上。本专利技术可以应用到任何人类线粒体疾病相关或基于线粒体单倍型信息的法医学及人类起源研究与应用中。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人类线粒体全长单倍型测定及遗传变异分析方法，其特征在于：所述方法主要是通过引物扩增一次性获得人类线粒体基因组的模板，然后通过SMRT测序技术获得线粒体全长序列，再将获得的序列进行生物信息学分析，从而得到变异信息。

【技术特征摘要】
1.一种人类线粒体全长单倍型测定及遗传变异分析方法，其特征在于：所述方法主要是通过引物扩增一次性获得人类线粒体基因组的模板，然后通过SMRT测序技术获得线粒体全长序列，再将获得的序列进行生物信息学分析，从而得到变异信息。2.根据权利要求1所述的人类线粒体全长单倍型测定及遗传变异分析方法，其特征在于：包括如下步骤：1)提取人线粒体全基因组DNA；2)通过一对引物进行PCR扩增获得线粒体全基因组DNA模板，即PCR产物；3)将获得的所有PCR产物均匀混合形成DNA池；4)将DNA池通过SMRT测序技术构建成20K文库后，于PacBioRSⅡ测序仪上进行测序及序列多态性分析，即可获得线粒体遗传变异信息。3.根据权利要求2所...

【专利技术属性】
技术研发人员：万君兴，王翠芳，陈长风，白玉杰，华子昂，靳宝锋，
申请(专利权)人：华子昂，
类型：发明
国别省市：辽宁,21