检测CBR3基因rs1056892位点多态性的人工模拟核酸分子信标与试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种CBR3基因rs1056892位点多态性的分型检测方法与试剂盒。本发明专利技术采用CBR3基因特异性的引物SEQ1和SEQ2扩增CBR3基因片段，同时在CBR3基因特异性的引物界定的扩增区域内设计CBR3基因特异性人工模拟核酸分子信标SEQ3‑FAM和SEQ4‑VIC。本发明专利技术提供的基于基因特异性PCR结合人工模拟核酸分子信标判断CBR3基因rs1056892位点多态性的方法不仅准确率高，而且还具有检测速度快、操作简单、结果判读客观、闭管反应污染少等优点，非常适合于在临床中大规模开展。

【技术实现步骤摘要】
检测CBR3基因rs1056892位点多态性的人工模拟核酸分子信标与试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及CBR3基因rs1056892位点多态性的分型检测方法与试剂盒。
技术介绍
癌症是一种涉及细胞异常增殖的疾病，有可能扩散到身体其它部位。目前已知超过一百种癌症影响着人类的健康。癌症的风险随着年龄增长而显著增加，许多癌症在发达国家较为常见。随着人口老龄化的加快以及发展中国家生活方式的改变，癌症的发病率正在逐年增加，对个人及家庭造成沉重的负担。蒽环类药物是一类来源于波赛链霉菌青灰变种的化疗药物，是迄今为止开发出的最有效的抗癌疗法之一。相比于其它化疗药物，蒽环类药物可以有效治疗更多种类的癌症，包括白血病、淋巴瘤、乳腺癌、胃癌、子宫癌、卵巢癌、膀胱癌和肺癌。但这一类药物的主要副作用是产生心脏毒性，这极大地限制了它们的使用。其中，与蒽环类药物相关的充血性心力衰竭（CHF）是患癌儿童中一个长期的并发症。60%接受蒽环类药物治疗的患者出现了心脏结构及功能异常，4%~5%具有明显的CHF临床症状。遗传变异在慢性心脏发病机制中具有潜在的作用。近些年的研究表明，CBR3基因rs1056892（A/G）位点的多态性与CHF的风险之间存在关联的趋势。CBR3全称羰基还原酶3，其催化大量生物学和药理学活性的羰基化合物还原为具有心脏毒性的醇代谢物，如阿霉素、柔红霉素。与A等位基因型纯合子个体相比，G等位基因型的纯合子个体的蒽环类相关CHF风险增加8倍。功能性CBR3rs1056892(A/G)多态性可能通过调节心脏毒性蒽环类酒精代谢物的心内形成，对儿童癌症幸存者中蒽环类相关CHF的风险产生影响。因此，G/G纯合型的儿童癌症患者应该更加注意蒽环类药物对心脏的影响；检测rs1056892（A/G）多态性位点可以为癌症的个体化用药，预防CHF的形成提供科学依据。目前，基因多态性检测的方法主要有PCR-Sanger测序法、芯片杂交法、高分辨率溶解曲线法等。这些方法虽然都可以在一定程度上检测基因多态性，但都有不可忽视的局限性。Sanger测序法步骤较多，需要PCR后处理，不仅操作繁琐，还易产生污染，并不能满足临床的需求。芯片杂交法操作繁琐，其检测还依赖于昂贵的设备仪器，导致成本较高。高分辨率溶解曲线法对仪器要求高，需要具有安装高分辨率软件、温度比较敏感的机器才能使用，临床推广存在困难。基于Taqman水解探针的荧光定量PCR，利用Taq酶的外切酶活性，切断探针产生荧光信号，由于Taqman探针荧光基团与淬灭基团并不紧密靠近，导致荧光淬灭不彻底，存在背景荧光信号。此外，Taqman探针对于单碱基错配识别能力较差，极易生成非特异荧光信号，干扰结果判读，进而影响检测的准确性。因此，临床上迫切需要一种简便易行、灵敏度高、准确可靠的检测基因多态性的方法。分子信标（MolecularBeacon）在空间结构上呈发夹型，由环状区和茎干区组成，环状区与靶DNA序列互补，长约15-35个核苷酸，茎杆区长约5-7个核苷酸，由GC含量较高的与靶序列无关的互补序列构成，分子信标的5′端标记荧光基团（F），3′端标记淬灭基团（Q）。对于分子信标来说，自由状态时，荧光基团与淬灭基团靠近（约为7-10nm）。此时发生荧光共振能量转移，使荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被淬灭，荧光本底极低。当分子信标的环状区与序列完全互补的靶DNA杂交形成双链杂交体时，分子信标茎杆区被拉开，荧光基团和淬灭基团距离增大。根据Foerster理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比，因此，杂交后分子信标的荧光几乎100%恢复，且所检测到的荧光强度与溶液中靶DNA的量成正比（图1）。因此，理想的分子信标比Taqman水解探针更为高效。然而，由于分子信标中与靶序列无关的茎杆区的引入导致分子信标与模板序列之间常会产生一些非特异性相互作用，从而导致背景信号增强，进而影响检测效率。而要消除这种背景信号，就会对分子信标的设计尤其是茎杆区的序列设计产生很高的要求。此外，研究显示分子信标在环状区序列较短时，用于检测基因突变（包括单碱基的错配、缺失或插入突变）效果较好，但实际上，很多时候，由于特定靶序列区的GC含量较低，往往会导致环状区序列过长，从而影响检测效率。因此，得到一个理想的分子信标往往比较困难。针对碱基的修饰改造也就是人工模拟的非天然核苷酸对的研究发展至今已有近40年的历史，这其中异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸（isoC-isoG）及其衍生物5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸（isoMeC-isoG）中的人工核苷酸对堪称经典。有关isoC-isoG中的核苷酸对的研究工作最早是由美国著名合成生物学家BennerSA开展的，其团队实现了异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸（isoC-isoG）的人工扩展核酸在体外的复制、转录乃至翻译的整个中心法则。如图2所示，isoC和isoG分别是天然核苷酸C和G的异构体，它们自身可以完美配对，但无法与天然核苷酸之间形成配对。除了以上人工对碱基结构的改造，还有一大类基于对碱基糖环的改造的非天然核酸，如锁核酸（LNA）。LNA泛指含有一个或多个LNA单体（锁核苷酸）的寡核苷酸序列，是一类近年来迅速发展起来的并且已经在分子诊断、基因治疗等领域得到广泛应用的人工模拟核酸。如图3所示，LNA单体的戊糖环的2’-O和4’-C之间形成了一个亚甲基桥。LNA不改变天然核酸的碱基配对，但相对于天然核酸有着更强的亲和力以及更强的错配识别能力。
技术实现思路
本专利技术的目的是基于人工模拟核酸的分子信标提供一种新型的CBR3基因rs1056892多态性位点的分型检测方法与试剂盒。为实现上述目的，本专利技术首先提供了用于检测人CBR3基因rs1056892位点多态性的分子信标。本专利技术提供的用于检测人CBR3基因rs1056892位点多态性的分子信标由分子信标甲和分子信标乙组成；所述分子信标甲的序列为序列表中序列2，其中，序列2第2位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第3位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，第15位为锁核苷酸残基，第29位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第30位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，其余核苷酸残基均为天然核苷酸残基；所述分子信标乙的序列为序列表中序列3，其中，序列3第2位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第3位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，第15位为锁核苷酸残基，第29位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第30位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，其余核苷酸残基均为天然核苷酸残基。所述分子信标甲和所述分子信标乙的第7-25位均为环状区序列，第1-6位及第26-31位均为茎干区序列。所述分子信标甲和所述分子信标乙的环状区均靶向CBR3基因rs1056892位点。其中，所述分子信标甲靶向CBR3基因rs1056892位点的“A”；所述分子信标乙靶向CBR3基因rs1056892位点的“G”。进一步的，所述分子信标甲和所述分子信标乙的两端还标记有荧光基团本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测人CBR3基因rs1056892位点多态性的分子信标，其由分子信标甲和分子信标乙组成；/n所述分子信标甲的序列为序列表中序列2，其中，序列2第2位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第3位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，第15位为锁核苷酸残基，第29位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第30位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，其余核苷酸残基均为天然核苷酸残基；/n所述分子信标乙的序列为序列表中序列3，其中，序列3第2位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第3位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，第15位为锁核苷酸残基，第29位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第30位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，其余核苷酸残基均为天然核苷酸残基。/n

【技术特征摘要】
1.用于检测人CBR3基因rs1056892位点多态性的分子信标，其由分子信标甲和分子信标乙组成；
所述分子信标甲的序列为序列表中序列2，其中，序列2第2位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第3位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，第15位为锁核苷酸残基，第29位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第30位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，其余核苷酸残基均为天然核苷酸残基；
所述分子信标乙的序列为序列表中序列3，其中，序列3第2位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第3位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，第15位为锁核苷酸残基，第29位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第30位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，其余核苷酸残基均为天然核苷酸残基。


2.根据权利要求1所述的分子信标，其特征在于：所述分子信标甲和所述分子信标乙的两端均标记有荧光基团和淬灭基团，且所述分子信标甲和所述分子信标乙标记的荧光基团不同。


3.根据权利要求2所述的分子信标，其特征在于：所述分子信标甲标记有FAM荧光基团；所述分子信标乙标记有VIC荧光基团。


4.用于检测人CBR3基因rs1056892位点多态性的...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛猛，潘世让，杜柏均，余倩，王宏伟，
申请(专利权)人：北京福安华生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11