一种抗原特异性T淋巴细胞冻存液及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种抗原特异性T淋巴细胞冻存液，包括冻存液A和冻存液B，冻存液A包括以下体积分数的组分：30％‑40％的勃脉力电解质注射液、30％‑40％的葡萄糖氯化钠注射液、5％‑15％的右旋糖酐葡萄糖注射液和15％‑25％的人血白蛋白溶液；冻存液B包括以下体积分数的组分：20％‑30％的勃脉力电解质注射液、20％‑30％的葡萄糖氯化钠注射液、5％‑15％的右旋糖酐葡萄糖注射液、15％‑25％的人血白蛋白溶液和10％‑20％的二甲基亚砜；冻存液A与冻存液B分开储存，使用时，冻存液A与冻存液B按体积比为1:0.5‑2的比例混合，形成抗原特异性T淋巴细胞冻存液。该冻存液能够降低细胞内的晶体形成，提升细胞活率，保持细胞的肿瘤杀伤功能。本发明专利技术还提供了冻存液的制备方法和应用以及一种抗原特异性T淋巴细胞注射液。

Antigen specific T lymphocyte frozen liquid, preparation method and application thereof

The present invention provides an antigen specific T cell freezing medium, including frozen liquid A and frozen liquid B, frozen liquid volume fraction of A includes the following components: Human Albumin 30% solution 40% plasma Lyte electrolyte injection, 30% 40% Glucose and Sodium Chloride Injection, 5% Glucose Injection and 15% 15% dextran 25%; frozen liquid volume fraction of B includes the following components: two dimethyl sulfoxide 20% 30% plasma Lyte electrolyte injection and 30%, 5% and 20% Glucose and Sodium Chloride Injection 15% Glucose Injection, 15% dextran 25% solution and 10% Human Albumin 20%; frozen liquid and frozen liquid A B are stored separately, when in use, the frozen liquid and frozen liquid A B according to the volume ratio of 1:0.5 2 mixing ratio, the formation of antigen specific T cell freezing medium. The cryopreservation solution can reduce the intracellular crystal formation, increase cell viability and maintain the tumor killing function of the cells. The invention also provides the preparation method and application of the freeze-dried liquid and an antigen specific T lymphocyte injection.

【技术实现步骤摘要】
一种抗原特异性T淋巴细胞冻存液及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种抗原特异性T淋巴细胞冻存液及其制备方法和应用。
技术介绍
基因修饰免疫细胞治疗技术是一种新兴的肿瘤治疗模式，已经成为全球的研究热点，特别是以CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)/TCR-T(嵌合型T细胞)技术为主要代表，成为全球生物医学新世纪的主要发展方向。目前认为经体外扩增遗传修饰的免疫细胞后再回输到人体内，有利于提高机体的免疫防御能力，表现在可以提高机体对特异性抗肿瘤等疾病的治疗能力。在细胞免疫治疗过程中，不仅需要培养和促进细胞的增殖，特别是在体外培养一段时间后，随着传代次数的增加和体外环境条件的变化，免疫细胞的各种生物特性都将逐渐发生变化并而不断有新的变化，因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要是采用添加适量保护剂的缓慢冷冻法来冻存细胞，如采用甘油或二甲基亚砜(DMSO)为保护剂，因为如果细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应，如：细胞脱水使局部电解质浓度增高、导致pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，从而引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易被破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。现有的冻存方案常采用：70％-80％DMEM/1640基础培养基，10％-20％胎牛血清和10％二甲基亚砜(DMSO)的冻存方案去保存细胞，该方案能够很好的为动物细胞提供营养物质，细胞经短时间冻存再复苏后仍能维持较高的活率。但是该细胞冻存方案经长时间冻存后细胞复苏率较低，只有70％-80％左右，直接制约冻存细胞的临床应用。且现有的冻存方法对于免疫细胞，在冻存过程中则易形成冰晶损伤细胞，复苏后存在细胞活率低、细胞增殖数量不足和细胞杀伤功能低下等问题。因此，免疫细胞治疗的临床应用急需一种能够防止冻存过程中的细胞损伤、保持细胞复苏后的高活率及其功能的细胞冻存液。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种抗原特异性T淋巴细胞冻存液及其制备方法。本专利技术抗原特异性T淋巴细胞冻存液可以提升细胞活率，抗原特异性T淋巴细胞冻存液的制备方法工艺简单。本专利技术第一方面提供了一种抗原特异性T淋巴细胞冻存液，包括冻存液A和冻存液B，所述冻存液A包括以下体积分数的组分：30％-40％的勃脉力电解质注射液、30％-40％的葡萄糖氯化钠注射液、5％-15％的右旋糖酐葡萄糖注射液和15％-25％的人血白蛋白溶液；所述冻存液B包括以下体积分数的组分：20％-30％的勃脉力电解质注射液、20％-30％的葡萄糖氯化钠注射液、5％-15％的右旋糖酐葡萄糖注射液、15％-25％的人血白蛋白溶液和10％-20％的二甲基亚砜；所述冻存液A与所述冻存液B分开储存，使用时，所述冻存液A与所述冻存液B按体积比为1:0.5-2的比例混合，形成抗原特异性T淋巴细胞冻存液。优选地，所述冻存液A包括以下体积分数的组分：35％的勃脉力电解质注射液、35％的葡萄糖氯化钠注射液、10％的右旋糖酐葡萄糖注射液和20％的人血白蛋白溶液；所述冻存液B包括以下体积分数的组分：27.5％的勃脉力电解质注射液、27.5％的葡萄糖氯化钠注射液、10％的右旋糖酐葡萄糖注射液、20％的人血白蛋白溶液和15％的二甲基亚砜。优选地，所述冻存液A与所述冻存液B的体积比为1:1。优选地，所述葡萄糖氯化钠注射液中含有质量浓度为5％的右旋葡萄糖和0.45％的氯化钠，所述右旋糖酐葡萄糖注射液中含有质量浓度为10％的低分子量右旋糖苷和5％的右旋葡萄糖。优选地，所述人血白蛋白溶液中含有质量浓度为25％的人血白蛋白。本专利技术第一方面提供的冻存液配比合理，能够降低细胞内的晶体形成，减少细胞内水凝固所形成的高浓度溶质对细胞造成的低温损伤，提升细胞活率；并能减少免疫细胞表面抗原的丢失，保持T细胞的肿瘤杀伤功能。所有组分均可以直接回输人体，在临床应用中具有方便、快捷等显著优势，本专利技术冻存液所有组分明确，可以工业化生产，原材料价格便宜，易获取，具有成本优势。本专利技术第二方面提供了一种抗原特异性T淋巴细胞冻存液的制备方法，包括：将勃脉力电解质注射液、葡萄糖氯化钠注射液、右旋糖酐葡萄糖注射液和人血白蛋白溶液分别按照体积分数为30％-40％、30％-40％、5％-15％和15％-25％进行混合，制得冻存液A；将勃脉力电解质注射液、葡萄糖氯化钠注射液、右旋糖酐葡萄糖注射液、人血白蛋白溶液和二甲基亚砜分别按照体积分数为20％-30％、20％-30％、5％-15％、15％-25％和10％-20％进行混合，制得冻存液B；所述冻存液A与所述冻存液B分开储存，使用时，将所述冻存液A与所述冻存液B按照体积比为1:0.5-2的比例混合，得到冻存液。本专利技术第二方面提供的制备方法，方法简单易操作，制备成本较低，易于产业化生产。本专利技术第三方面提供了一种如第一方面所述的冻存液在抗原特异性T淋巴细胞冻存中的应用，包括：(1)取所述冻存液，所述冻存液包括冻存液A和冻存液B；取对数生长期的抗原特异性T淋巴细胞；(2)向所述抗原特异性T淋巴细胞中加入所述冻存液A，得到细胞重悬液；然后加入冻存液B，得到细胞冻存液，所述冻存液A与所述冻存液B的体积比为1:0.5-2，冻存所述细胞冻存液，得到冻存的抗原特异性T淋巴细胞。优选地，所述细胞重悬液中的所述抗原特异性T淋巴细胞的浓度为1×106个/mL-10×106个/mL。优选地，冻存结束后，将所述冻存后的所述抗原特异性T淋巴细胞进行复苏，所述复苏的方法包括：将冻存后的细胞冻存液置于37℃水浴锅中，迅速晃动直至冻存液完全融解，得到复苏后的抗原特异性T淋巴细胞。本专利技术第三方面提供的应用，该冻存液能够冻存细胞，相对其他冻存液能够更有效的保持细胞的复苏成活率，促进其增殖能力，并提高细胞活性，减少免疫细胞表面抗原的丢失，保持T细胞的肿瘤杀伤功能。且本专利技术冻存液重悬的细胞可直接回输体内。本专利技术第四方面提供了一种抗原特异性T淋巴细胞注射液，包括抗原特异性T淋巴细胞和第一方面所述的细胞冻存液，所述细胞注射液中，所述抗原特异性T淋巴细胞的浓度为0.5×106个/mL-2×106个/mL。本专利技术第四方面提供的注射液，可以直接回输体内，无需经过额外的处理工序，从而减少操作流程，降低污染概率。本专利技术冻存液和血液成分相容，可作为水、电解质的补充源和碱化剂。综上，本专利技术有益效果包括以下几个方面：1、本专利技术提供的冻存液能够降低细胞内的晶体形成，减少细胞内水凝固所形成的高浓度溶质对细胞造成的低温损伤，提升细胞活率；并能减少免疫细胞表面抗原的丢失，保持T细胞的肿瘤杀伤功能；2、本专利技术提供的冻存液的制备方法，方法简单易操作，制备成本较低，易于产业化生产；3、本专利技术提供的冻存液的应用，相对其他冻存液，本专利技术冻存液能够更有效的保持细胞的复苏成活率，促进其增殖能力，并提高细胞活性，减少免疫细胞表面抗原的丢失，保持T细胞的肿瘤杀伤功能。且本专利技术冻存液重悬的细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗原特异性T淋巴细胞冻存液，其特征在于，包括冻存液A和冻存液B，所述冻存液A包括以下体积分数的组分：30％‑40％的勃脉力电解质注射液、30％‑40％的葡萄糖氯化钠注射液、5％‑15％的右旋糖酐葡萄糖注射液和15％‑25％的人血白蛋白溶液；所述冻存液B包括以下体积分数的组分：20％‑30％的勃脉力电解质注射液、20％‑30％的葡萄糖氯化钠注射液、5％‑15％的右旋糖酐葡萄糖注射液、15％‑25％的人血白蛋白溶液和10％‑20％的二甲基亚砜；所述冻存液A与所述冻存液B分开储存，使用时，所述冻存液A与所述冻存液B按体积比为1:0.5‑2的比例混合，形成抗原特异性T淋巴细胞冻存液。

【技术特征摘要】
1.一种抗原特异性T淋巴细胞冻存液，其特征在于，包括冻存液A和冻存液B，所述冻存液A包括以下体积分数的组分：30％-40％的勃脉力电解质注射液、30％-40％的葡萄糖氯化钠注射液、5％-15％的右旋糖酐葡萄糖注射液和15％-25％的人血白蛋白溶液；所述冻存液B包括以下体积分数的组分：20％-30％的勃脉力电解质注射液、20％-30％的葡萄糖氯化钠注射液、5％-15％的右旋糖酐葡萄糖注射液、15％-25％的人血白蛋白溶液和10％-20％的二甲基亚砜；所述冻存液A与所述冻存液B分开储存，使用时，所述冻存液A与所述冻存液B按体积比为1:0.5-2的比例混合，形成抗原特异性T淋巴细胞冻存液。2.如权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液A包括以下体积分数的组分：35％的勃脉力电解质注射液、35％的葡萄糖氯化钠注射液、10％的右旋糖酐葡萄糖注射液和20％的人血白蛋白溶液；所述冻存液B包括以下体积分数的组分：27.5％的勃脉力电解质注射液、27.5％的葡萄糖氯化钠注射液、10％的右旋糖酐葡萄糖注射液、20％的人血白蛋白溶液和15％的二甲基亚砜。3.如权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液A与所述冻存液B的体积比为1:1。4.如权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述葡萄糖氯化钠注射液中含有质量浓度为5％的右旋葡萄糖和0.45％的氯化钠，所述右旋糖酐葡萄糖注射液中含有质量浓度为10％的低分子量右旋糖苷和5％的右旋葡萄糖。5.如权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述人血白蛋白溶液中含有质量浓度为25％的人血白蛋白。6.一种抗原特异性T淋巴细胞冻存液的制备方法，其特征在于，包括：将勃脉力电解质注射液、葡萄糖氯...

【专利技术属性】
技术研发人员：张长风，
申请(专利权)人：深圳宾德生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44