含有新型插入位点的羊痘病毒载体和应用制造技术

本发明专利技术提供含有新型插入位点的山羊痘载体基因工程毒株GTPV Δ135/EGFP和绵羊痘病毒基因工程毒株SPPV Δ135/EGFP，它们的保藏变编号分别为CCTCC NO：V201714和CCTCC NO：V201715。它们缺失135ORF，并选择该处为新型插入位点，可以构建一系列重组病毒疫苗株。本发明专利技术还构建了表达小反刍兽疫病毒(PPRV)的H基因和H/F基因的重组羊痘病毒疫苗株。

【技术实现步骤摘要】
含有新型插入位点的羊痘病毒载体和应用
本专利技术属于动物基因工程
，具体涉及一种含有新型插入位点的羊痘病毒，该病毒缺失了135ORF，并选择该处为新型插入位点，该疫苗株毒株免疫原性没有影响，表达外源基因的能力强于传统的TK基因插入位点。本专利技术还包括以所述病毒为载体疫苗利用所述含有新型插入位点的羊痘病毒疫苗株制备的羊痘疫苗以及它们的应用。
技术介绍
羊痘病毒(Capripoxvirus，CPV)是痘病毒科(Poxviridae)、脊索动物痘病毒亚科(Chordopoxrinae)、羊痘病毒属(Capripoxvirus)成员，包括山羊痘病毒(Goatpoxvirus，GTPV)和绵羊痘病毒(Sheeppoxvirus)。羊痘，是羊痘病毒引起的一种急性高度接触性的传染病，主要通过气溶胶和紧密接触进行传播。羊痘主要分布于非洲、中东、印度、北欧、地中海各国及德国、澳大利亚、美国等，特别是非洲的北部、中东和亚洲的部分国家流行较为严重。与我国接壤的周边国家，如印度、俄罗斯、蒙古等国家均有本病的流行。我国贵州、新疆、福建、山西、辽宁、吉林、黑龙江、江苏、四川、上海等都有过羊痘发生的相关报道。因为该病具有高致病率和高致死率的特点，所以羊痘给养羊业造成巨大的经济损失，并且严重影响国际贸易，因此OIE将其列为法定通报的动物疫病，我国将其列为一类动物传染病。现在防控用的疫苗都是体外传代致弱的疫苗株。而基因工程疫苗的研究热点是TK基因，该基因作为插入位点已经普遍用于痘病毒和疱疹病毒疫苗的研制中。山羊痘病毒是双股DNA病毒，病毒基因组共有147个开放阅读框(ORF)，编码密度为93％，所编码的蛋白质长度为53-2027个氨基酸不等，基因组中间的区域(ORF024-ORF123)有与其它痘病毒同源的保守序列，这些序列与病毒复制相关。羊痘病毒也和其它痘病毒一样，基因组包括一个中间编码区和两端相同的末端反向重复序列(invertedterminalrepeat，ITR)。羊痘病毒作为载体已经广泛应用于羊病预防。TK基因由于其便于筛选，已经成为痘病毒的常用插入位点。但是也存着问题，虽然该基因是病毒复制非必需，但是缺失突变后，对病毒的复制有明显地影响。利用TK插入位点，已经有表达羊蓝舌病病毒、小反刍兽疫病毒、传染性脓疱病毒、羊口蹄疫病毒等抗原基因的重组山羊痘病毒(CaufourPetal.Vaccine，2004；MaWetal.ArchVirol，2014；ZhangQetal.，WeiShengWuXueBao，2014；Wade-EvansAMetal.Virology，1996；BNB；Wetal.Vaccine，2010.)的报道，但是该位点的缺失，导致了载体病毒自身的复制能力降低，进而影响了病毒载体毒和插入的外源蛋白的免疫原性并且需要大剂量免疫(ChenWetal.Vaccine，2010)，进而影响了其作为载体苗的免疫效力。羊痘病毒在我国普遍流行，严重危害养殖业的发展而我国尚无应对措施，所以能够研制出既保留了载体的免疫原性并且能够良好地表达外源基因的安全性强的新型疫苗是非常有意义的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种免疫原性好和安全性强的羊痘载体(例如，改造的山羊痘病毒AV41株和绵羊痘疫苗株)基因工程毒株及其在构建疫苗株中的应用。本专利技术的羊痘载体基因工程毒株的免疫原性和安全性优于目前本领域常用的利用传统TK插入位点构建的羊痘载体基因工程毒株。在第一方面，本专利技术提供一种免疫原性好和安全性强的羊痘载体基因工程毒株。本专利技术的羊痘载体基因工程毒株具有新型插入位点，其以羊痘病毒的135ORF位点作为插入位点，可以将其他病原的抗原基因插入到该位点，从而构建表达这些外源抗原的重组羊痘病毒基因工程疫苗毒株。例如，可以将小反刍兽疫病毒(Pestedespetitsruminantsvirus，PPRV)的H蛋白编码基因和/或F蛋白编码基因等插入到该位点而构建一系列具有良好的免疫原性和安全性的羊痘病毒基因工程疫苗。具体而言，本专利技术人构建了一种重组山羊痘病毒基因工程毒株GTPVΔ135/EGFP，该基因工程毒株于2017年4月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，地址：中国湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072)，保藏编号为CCTCC-V201714；以及一种重组绵羊痘病毒基因工程毒株SPPVΔ135/EGFP，其于2017年4月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC-V201715。在第二方面，本专利技术提供第一方面的具有新型插入位点的羊痘病毒载体基因工程毒株在制备羊痘病毒基因工程疫苗中的应用。在第三方面，本专利技术提供了一种制备重组羊痘病毒基因工程疫苗的方法，所述方法通过将靶标外源基因插入到第一方面所述的羊痘病毒载体基因工程毒株的135ORF位点而进行。优选地，所述外源基因的插入通过同源重组进行。所述靶标外源基因可以是来自羊蓝舌病病毒、小反刍兽疫病毒、传染性脓疱病毒、羊口蹄疫病毒、羊布鲁氏菌或其它病原的一种或多种抗原基因。例如，所述靶标外源基因为小反刍兽疫病毒的H基因或F基因或二者的组合。本领域技术人员应该理解，通过将靶标外源基因插入到第一方面所述的羊痘病毒载体基因工程毒株的135ORF位点而构建的重组羊痘病毒基因工程疫苗能够同时预防或治疗羊痘病毒引起的羊痘和与所述靶标外源基因相关的病原引起的疾病。例如，本专利技术包含小反刍兽疫病毒的H或F基因的重组羊痘病毒能够同时预防或治疗羊痘和小反刍兽疫。在第四方面，本专利技术提供了一系列通过将靶标外源基因插入到第一方面的羊痘病毒载体基因工程毒株的135ORF位点而构建的重组羊痘病毒基因工程疫苗。与利用传统的TK基因插入位点构建的重组羊痘病毒基因工程疫苗具相比，所述重组羊痘病毒基因工程疫苗具有良好的免疫原性和安全性。在一个实施方案中，通过将来自羊蓝舌病病毒、小反刍兽疫病毒、传染性脓疱病毒、羊口蹄疫病毒、羊布鲁氏菌或其它病原的一种或多种抗原基因插入到第一方面的羊痘病毒载体基因工程毒株的135ORF位点，构建得到表达相应的一种或多种外源抗原基因的重组羊痘病毒基因工程疫苗。在一个优选的实施方案中，将小反刍兽疫病毒的H基因或F基因或二者的组合插入到第一方面的羊痘病毒载体基因工程毒株的135ORF位点，构建得到的重组羊痘病毒基因工程疫苗能够用于预防或治疗羊痘病毒和小反刍兽疫病毒引起的疾病。在一个具体的实施方案中，小反刍兽疫病毒的H基因或F基因的插入通过同源重组进行。在一个具体的实施方案中，本专利技术人合成包含7.5启动子和小反刍兽疫病毒(PPRV)的H基因(SEQIDNO：22)，同时在基因两端引入NotI酶切位点，pB-Δ135/EGFP经NotI酶切，将通过NotI酶切位点将7.5启动子和PPRVH连入到上下游同源臂之间，构建成pB-Δ135/PPRVH重组质粒。将纯化好的重组Δ135/EGFP缺失株作为亲本(GTPVΔ135/EGFP和SPPVΔ135/EGFP)，进行增殖扩增，提取重组羊痘病毒Δ135/EGFP缺失株基因组DNA，用NotI进行酶切，回收酶切后的基因组DNA。将转移质粒pB-Δ135/PPRVH与回收后的病毒基因组共转染于LT细胞，待出现CPE(细胞病变)，即是目本文档来自技高网...

【技术保护点】
以羊痘病毒的135ORF位点作为插入位点的羊痘病毒载体基因工程毒株，所述羊痘病毒载体基因工程毒株为保藏号为CCTCC NO：V201714的重组山羊痘病毒基因工程毒株，其命名为GTPVΔ135/EGFP，和保藏号为CCTCC NO：V201715的重组绵羊痘病毒基因工程毒株，其命名为SPPVΔ135/EGFP。

【技术特征摘要】
1.以羊痘病毒的135ORF位点作为插入位点的羊痘病毒载体基因工程毒株，所述羊痘病毒载体基因工程毒株为保藏号为CCTCCNO：V201714的重组山羊痘病毒基因工程毒株，其命名为GTPVΔ135/EGFP，和保藏号为CCTCCNO：V201715的重组绵羊痘病毒基因工程毒株，其命名为SPPVΔ135/EGFP。2.权利要求1所述的羊痘病毒载体基因工程毒株在制备羊痘病毒基因工程疫苗中的应用。3.一种制备重组羊痘病毒基因工程疫苗的方法，所述方法通过将靶标外源基因插入到权利要求1所述的羊痘病毒载体基因工程毒株的135ORF位点而进行。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述靶标外源基因为来自羊蓝舌病病毒、小反刍兽疫病毒、传染性脓疱病毒、羊口蹄疫病毒、羊布鲁氏菌的一种或多种抗原基因。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述靶标外源基因为小反刍兽疫病毒的H基因或F基因或二者的组合。6.根据权利要求3...

【专利技术属性】
技术研发人员：步志高，张敏敏，陈伟业，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23