突变的猪流行性腹泻病毒用于在疫苗中的用途制造技术

本发明专利技术涉及突变的猪流行性腹泻病毒(PEDVdN)，生产所述PEDVdN的方法和包含PEDVdN的组合物。本发明专利技术还涉及包括给药PEDVdN刺激猪的免疫应答的方法，包含PEDVdN的疫苗以及预防或改善猪的猪流行性腹泻的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】突变的猪流行性腹泻病毒用于在疫苗中的用途
本专利技术涉及病毒介导的动物疾病，更具体地涉及病毒介导的动物疾病的预防。具体而言，本专利技术涉及猪流行性腹泻(PED)的预防。本专利技术涉及用于动物的疫苗接种的病原体，突变的猪流行性腹泻病毒。本专利技术的突变的病毒导致针对猪流行性腹泻病毒的野生分离株感染的改进性保护。
技术介绍
猪流行性腹泻病毒(PEDV，PorcineEpidemicDiarrheaVirus)是一种致死性病毒，在猪中，尤其是仔猪中会引起称为猪流行性腹泻(PED)的疾病。PED是一种急性的且高度传染性的肠道疾病，其特征在于严重肠炎，呕吐和水性腹泻。该疾病在新生仔猪中最严重，因为它们更容易脱水。在不到1周龄的猪中，新生猪的死亡率可高达100％。PEDV在英国于1971年首次被发现，且它在1970年代和1980年代的欧洲造成大规模流行。它自那时以来已经扩散到亚洲，自1982年以来在亚洲已经认为是流性行的，对猪肉生产者造成巨大的经济损失。PED在2013年5月首次在美国被诊断出，且在2014年1月在加拿大首次被诊断出。该病毒能够通过粪-口途径(faecal-oralroute)快速扩散并感染整个兽群。PEDV是冠状病毒科的网巢病毒目(orderNidovirales)的成员。网巢病毒目采用正极性的单链多顺反子RNA基因组，其指导包括RNA依赖性RNA聚合酶和解旋酶的复制复合物的亚单位的合成。复制酶基因表达是在核糖体移码信号和糜蛋白酶样蛋白酶的主要控制之下，其由一种或多种木瓜蛋白酶样蛋白酶辅助。合成一套嵌套的亚基因组RNA以表达3'-近端ORF。3'-近端ORF编码结构和非结构的蛋白。它们通过一套3'-端嵌套的亚基因组信使RNA进行表达。这些亚基因组mRNA编码至少四个结构蛋白，包括称为刺突(S)，膜(M)和包膜(E)蛋白的三个膜锚定蛋白，和包裹基因组RNA的核衣壳(N)蛋白。从亚基因组mRNA表达的非结构蛋白编码对于每个冠状病毒属特异性的辅助蛋白。位于S和E基因之间的一种辅助基因ORF3在不同的α-冠状病毒之间共享，并编码具有三至四个推定跨膜结构域的224个氨基酸(aa)长的蛋白(Wangetal.,2012.FEBSLett586:384-391)。已经开发了作为候选的减毒活疫苗的PEDV的Vero细胞适应株。然而，所得的疫苗株与最近的野生型PEDV分离株在遗传学上完全不同，因此或许不是通用的(Parketal.,2011.ArchVirol156:577-585；Panetal.,2012.VirologyJournal9:195)。另一个缺点是其潜在的毒性恢复和有毒病毒的随后扩散(Chenetal.,2010.ArchVirol155,1471-1476)。另外，常规的灭活疫苗被广泛使用，但是这些疫苗具有一些缺点，如高成本和有时较弱的保护效果(Suoetal.,2012.VirusResearch167:259–266；Leeetal.,2012.ClinExpVaccineRes1:18-34)。使用RNA平台式疫苗技术(Harrisvaccines)生产的疫苗最近已获得美国农业部(USDA)的条件许可。RNA平台使用了用于表达PEDV的刺突蛋白的α刺病毒基的表达系统。该疫苗的有效性可能有限，因为其仅表达已知是异质的刺突蛋白(Chenetal.,2013.Viruses5:2601-2613)。因此，迫切需要开发用于控制PED的新型且有效的疫苗。
技术实现思路
因此，本专利技术提供了突变的猪流行性腹泻病毒(PEDVdN)，其包含刺突蛋白的S1亚单位的N-端结构域的功能性失活。α的冠状病毒如PEDV的刺突(S)蛋白是锚定于病毒包膜中的约1255个氨基酸的大糖蛋白。S蛋白介导病毒颗粒与细胞的结合，以及细胞-病毒膜融合(Rotaetal.,2003.Science300:1394-1399)。S蛋白被宿主衍生的蛋白酶切割成两个亚单位：N-端S1亚单位和C-端膜锚定的S2亚单位，其中每个亚单位的大小约为150kDa。S1亚单位提供用于氨基肽酶N的结合域，氨肽酶N是许多α许冠状病毒的细胞表面受体(Belouzardetal.,2012.Viruses4,1011-1033)。α冠状病毒的刺突蛋白的长度范围为人HCoV229E(SwissProt登录号P15423)中的1173个氨基酸残基至猫科动物冠状病毒UU23(基因库(GenBank)登录号ADC35472.1)的1466个氨基酸残基。序列同一性不是很保守，显示出在整个刺突蛋白上仅22.94％的总体序列同一性。S1亚单位的N-端区域(“区域结构域”)包括PEDV的毒性菌株的S蛋白的公布序列的约氨基酸残基19至氨基酸残基233的区域，如GenBank中提供的参考编号JQ023161，其是不同α不冠状病毒之间的较不保守的区域，与S1亚单位的其余C-端部分的约38％的总序列同一性相比，具有约22％的总体序列同一性。已经鉴定的是传染性胃肠炎病毒(TGEV)和I型猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的天然变体都是α的冠状病毒，其中发现S1亚单位的N-结构域并不存在。猪呼吸道冠状病毒(PRCV)是TGEV的天然变体，并具有S1亚单位的N-结构域的缺失。PRCV不感染肠细胞，并因此不会引起腹泻。PRCV主要在肺中增殖，这表示S1亚单位的N结构域在与宿主细胞受体的相互作用中起作用。据认为PRCV已经天然地接种了猪群，因为PRCV感染可以导致与TGEV交叉反应的抗体的诱导。TGEV和PRCV都能够结合氨基肽酶N，并且已经发现氨基肽酶N结合结构域存在于TGEVS蛋白的氨基酸位置481至650处的S1亚单位的C-端部分中(Regueraetal.,2012.PLoSPathogens8,e1002859)。此外，在刺突蛋白的N-端区域内具有735bp的较大缺失的I型FIPV已被观察为FIPV的自发突变体。值得注意的是，在这种情况下，突变的病毒保持其毒性并且发现在感染的猫中诱导了猫感染性腹膜炎(Teradaetal.,2012.JGenVirol93:1930-4)。已知I型猫冠状病毒不能将氨基肽酶N识别为猫细胞系上的功能性受体(Dyeetal.,2007.JGenVirol88:1753-60)。这不仅表明受体结合域存在于S1亚单位的C-端部分，而且表明刺突蛋白的N-端区域的缺失不影响该冠状病毒的感染性和毒性。已经发现，PEDV的氨基肽酶N-结合结构域存在于S1亚单位的N-端部分中，包括氨基酸残基25-88(Leeetal.,2011.KoreanJMicrobiolBiotechnol39:140-145)。因此，令人惊讶的是，包含刺突蛋白的S1亚单位的N-端结构域(包括PEDV的推定的氨基肽酶N-结合结构域)的功能性失活的突变的PEDV能够感染细胞并在靶生物体中扩散。此外，已经发现所述突变的PEDV发生了减毒，从而影响该冠状病毒的毒性。冠状病毒的S1刺突亚单位的N-端区域是较不保守的，这能够反映了不同冠状病毒可以与氨基肽酶N(APN)蛋白的不同部分相互作用的事实。例如，据报道，HCV229E与APN蛋白的氨基-端部分相互作用，而TGEV和犬冠状病毒与APN蛋白的羧基端部分发生相互本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种突变的猪流行性腹泻病毒(PEDVdN)，包含在对应于SEQ ID NO：1的约氨基酸残基19至约氨基酸残基233的区域的区域内的三个或更多个氨基酸残基的缺失。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.08.08 EP 14180400.51.一种突变的猪流行性腹泻病毒(PEDVdN)，包含在对应于SEQIDNO：1的约氨基酸残基19至约氨基酸残基233的区域的区域内的三个或更多个氨基酸残基的缺失。2.根据权利要求1所述的PEDVdN，其功能性地表达刺突蛋白的S1亚单位的C-端结构域。3.根据权利要求1或权利要求2所述的PEDVdN，其中所述缺失包含SEQIDNO:1的具有氨基酸序列NKR的氨基酸残基194-196，或其他PEDV序列中的相应的氨基酸残基。4.根据权利要求1-3中任一项所述的PEDVdN，其中在对应于SEQIDNO:1的约氨基酸残基19至约氨基酸残基233的区域的区域内缺失所有氨基酸残基。5.根据权利要求1-4中任一项所述的PEDVdN，其中病毒基因组序列具有毒性PEDV。6.根据权利要求1-5中任一项所述的PEDV...

【专利技术属性】
技术研发人员：贝伦德·扬·博斯，佩特鲁斯·约瑟夫斯·玛丽·罗蒂尔，
申请(专利权)人：乌得勒支大学控股有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL