一种同时检测牛轮状病毒与牛病毒性腹泻病毒的双重RT-PCR方法及专用试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种同时检测牛轮状病毒与牛病毒性腹泻病毒的双重ＲＴ－ＰＣＲ方法，包括样品的采集，病毒ＲＮＡ的提取，特异性引物的设计，ＲＴ－ＰＣＲ扩增，琼脂糖凝胶电泳，结果判定等步骤；本发明专利技术同时还公开了同时检测牛轮状病毒与牛病毒性腹泻病毒的专用试剂盒，包括样品病毒ＲＮＡ提取试剂，反转录试剂盒，ＰＣＲ试剂盒，阳性对照品和阴性对照品。利用本发明专利技术方法和试剂盒可在一次ＲＴ－ＰＣＲ反应中同时检测出引起牛腹泻的两种病毒，检测敏感性为１ｐｇ病毒ＲＮＡ，具有很好的特异性和敏感性，本发明专利技术方法与病毒分离、中和试验、ＥＬＩＳＡ、核酸探针等方法相比，明显地降低了检测成本和检测时间，非常适于牛病毒性腹泻病的试验室快速诊断和流行病学研究。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种同时检测牛轮状病毒与牛病毒性腹泻病毒的双重ＲＴ－ＰＣＲ方法，步骤包括样品的采集，病毒ＲＮＡ的提取，特异性引物的设计，ＲＴ－ＰＣＲ扩增，琼脂糖凝胶电泳，结果判定；其特征在于：所述特异性引物包括牛轮状病毒特异性扩增引物和牛病毒性腹泻病毒特异性扩增引物，其序列是：牛轮状病毒所用的特异性扩增引物Ｐ１：５｀－ＧＴＡＴＧＧＴＡＴＴＧＡＡＴＡＴＡＣＣＡＣ－３｀，Ｐ２：５｀－ＧＡＴＣＣＴＧＴＴＧＧＣＣＡＴＣＣ－３｀；牛病毒性腹泻病毒所用的特异性扩增引物Ｐ３：５｀－ＧＴＡＧＴＣＧＴＣＡＧＴＧＧＴＴＣＧ－３｀，Ｐ４５｀－ＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴ－３｀；所述ＲＴ－ＰＣＲ扩增采用两步法，反转录时使用的引物为长９ｂｐ的随机引物（５｀－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３｀），ＰＣＲ反应时在１个ＰＣＲ反应管中同时加入了牛轮状病毒和牛 病毒性腹泻病毒的特异性上、下游引物Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４，其中：ＲＴ－ＰＣＲ反转录反应体系为１０μｌ，包含有ＲＮＡ模板２μｌ，ＭｇＣｌ↓［２］２μｌ，１０倍反转录缓冲液１μｌ，ＤＥＰＣ处理水２．７５μｌ，ｄＮＴＰ１μｌ，ＲＮａｓｅ抑制剂 ０．２５μｌ，ＡＭＶ反转录酶０．５μｌ，随机引物０．５μｌ；反应条件为３０℃１０ｍｉｎ，４２℃３０ｍｉｎ，９５℃５ｍｉｎ，５℃５ｍｉｎ；ＰＣＲ反应体系为５０μｌ，反转录反应后在反转录反应管中加入ＰＣＲ缓冲液１０μｌ，引物Ｐ１ 、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４各０．１μｌ，Ｔａｑ酶０．２５μｌ，灭菌三蒸水２９．３５μｌ；ＰＣＲ反应条件为：９４℃预变性２ｍｉｎ，９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２１ｍｉｎ，共３０个循环，然后７２℃１０ｍｉｎ；所述结果判定是以阳性对照ＰＣＲ产物 电泳后产生的３４２ｂｐ和１９６ｂｐ条带为标准对样品的结果进行判定，样品结果产生３４２ｂｐ条带的，判定为轮状病毒感染；样品结果产生１９６ｂｐ条带的，判定牛病毒性腹泻病毒感染；样品结果同时产生３４２ｂｐ和１９６ｂｐ两个条带的，判定为牛轮状病毒和牛病毒性腹泻病毒混合感染；样品结果没有任何条带的，则判为阴性。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨少华，王长法，高运东，杨宏军，
申请(专利权)人：山东奥克斯生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]