HPPD变体及使用方法技术

在本发明专利技术中，记载了HPPD酶以及包含所述酶、表现出对若干类HPPD抑制剂的完全耐受性的植物。设计了一组HPPD酶，其对HPPD抑制剂不具有亲和力或仅具有显著降低的亲和力，同时所述酶的HPPD抑制剂的解离率被增大到这样的程度：即使得HPPD抑制剂不再作为缓慢结合或缓慢‑紧密结合抑制剂而是成为完全可逆的抑制剂。具体地，提供了编码HPPD抑制剂耐受性多肽的分离的多聚核苷酸。此外，包括对应于所述多聚核苷酸的氨基酸序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】HPPD变体及使用方法
本专利技术涉及植物分子生物学，特别是赋予对HPPD抑制剂除草剂的改进的耐受性的新型HPPD多肽。
技术介绍
4-羟苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)是催化其中对羟苯丙酮酸(在本文中缩写为HPP)——一种酪氨酸降解产物——被转化为尿黑酸(在本文中缩写为HG)——生育酚和质体醌在植物中的前体——的反应的酶(CrouchN.P.etal.(1997),Tetrahedron,53,20,6993-7010,Fritzeetal.(2004),PlantPhysiology134:1388-1400)。生育酚作为膜相关抗氧化剂发挥作用。质体醌首先作为PSII和细胞色素b6/f复合体之间的电子载体发挥作用，其次，其是参与类胡萝卜素合成的八氢番茄红素脱氢酶的氧化还原辅因子。迄今为止，存在于NCBI数据库中的来自多种生物的超过1000种核酸序列被注释为编码具有HPPD结构域的推定蛋白。但是对于它们中的大多数，尚未在体外测定法中或在植物学方法中证明所述蛋白具有HPPD酶活性，也未证明当这类HPPD蛋白在植物中表达时其能够赋予对HPPD抑制剂除草剂的除草剂耐受性。现有技术中已记载了若本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组核酸分子，其编码4‑羟苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)蛋白，所述蛋白由在对应于SEQ ID NO:1的第335位氨基酸位置的氨基酸位置处包含脯氨酸，并且在对应于SEQ ID NO:1的第336位氨基酸位置的位置处包含苯丙氨酸或酪氨酸的氨基酸序列组成，其中所述HPPD蛋白能耐受HPPD抑制剂除草剂

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.13 EP 14159634.6;2014.03.11 US 61/951,0391.一种重组核酸分子，其编码4-羟苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)蛋白，所述蛋白由在对应于SEQIDNO:1的第335位氨基酸位置的氨基酸位置处包含脯氨酸，并且在对应于SEQIDNO:1的第336位氨基酸位置的位置处包含苯丙氨酸或酪氨酸的氨基酸序列组成，其中所述HPPD蛋白能耐受HPPD抑制剂除草剂2.权利要求1的重组核酸分子，其中所述编码的HPPD蛋白由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列还包含：i.在对应于SEQIDNO:1的第188位氨基酸位置的氨基酸位置处的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸；以及ii.在对应于SEQIDNO:1的第189位氨基酸位置的氨基酸位置处的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸；以及iii.在对应于SEQIDNO:1的第200位氨基酸位置的氨基酸位置处的异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；以及iv.在对应于SEQIDNO:1的第215位氨基酸位置的氨基酸位置处的丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸或天冬酰胺；v.在对应于SEQIDNO:1的第226位氨基酸位置的氨基酸位置处的组氨酸或谷氨酰胺；以及vi.在对应于SEQIDNO:1的第339位氨基酸位置的氨基酸位置处的组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸；以及vii.在对应于SEQIDNO:1的第340位氨基酸位置的氨基酸位置处的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸。3.权利要求1的重组核酸分子，其中所述编码的HPPD蛋白由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列还包含：i.在对应于SEQIDNO:1的第188位氨基酸位置的氨基酸位置处的丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、丝氨酸或色氨酸；以及ii.在对应于SEQIDNO:1的第189位氨基酸位置的氨基酸位置处的精氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、组氨酸、苯丙氨酸或丝氨酸；以及iii.在对应于SEQIDNO:1的第200位氨基酸位置的氨基酸位置处的异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；以及iv.在对应于SEQIDNO:1的第215位氨基酸位置的氨基酸位置处的丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸或天冬酰胺；以及v.在对应于SEQIDNO:1的第226位氨基酸位置的氨基酸位置处的组氨酸或谷氨酰胺；以及vi.在对应于SEQIDNO:1的第339位氨基酸位置的氨基酸位置处的丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺或赖氨酸；以及vii.在对应于SEQIDNO:1的第340位氨基酸位置的氨基酸位置处的丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸或亮氨酸。4.权利要求1、2或3的重组核酸分子，其中所述HPPD蛋白包含与SEQIDNO:1所示的氨基酸序列具有至少53％的序列同一性的氨基酸序列。5.权利要求1-4中任一项的重组核酸分子，其中其核苷酸序列是已被设计用于在植物中表达的合成序列。6.权利要求1-4中任一项的重组核酸分子，其中其核苷酸序列与能够指导所述核苷酸序列在植物细胞中表达的启动子可操作地连接。7.权利要求1的重组核酸分子，其中所述HPPD抑制剂除草剂选自N(1,2,5-噁二唑-3-基)苯甲酰胺、N-(四唑-4-基)-或N-(三唑-3-基)芳基甲酰胺、N-(1,3,4--噁二唑-2-基)苯甲酰胺、N-(四唑-5-基)-或N-(三唑-3-基)芳基甲酰胺、哒嗪酮衍生物、取代的1,2,5-噁二唑、oxoprazin衍生物、三酮、异噁唑和吡唑特。8.权利要求7的重组核酸分子，其中所述HPPD抑制剂除草剂选自2-氯-3-乙氧基-4-(甲磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑-5-基)苯甲酰胺和2-氯-3-(甲氧基甲基)-4-(甲磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑-5-基)苯甲酰胺、2-甲基-N-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-3-(甲磺酰基)-4-(三氟甲基)苯甲酰胺、2-氯-3-乙氧基-4-(甲磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑-5-基)苯甲酰胺、4-(二氟甲基)-2-甲氧基-3-(甲磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑-5-基)苯甲酰胺、2-氯-3-(甲基硫烷基)-N-(1-甲基-1H-四唑-5-基)-4-(三氟甲基)苯甲酰胺、2-(甲氧基甲基)-3-(甲基亚硫酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑-5-基)-4-(三氟甲基)苯甲酰胺、环磺酮、磺草酮、甲基磺草酮、异噁唑草酮、磺酰草吡唑和苯吡唑草酮。9.一种宿主细胞，其包含权利要求1、2或3的重组核酸分子。10.权利要求9的宿主细胞，其为细菌宿主细胞。11.权利要求9的宿主细胞，其为植物细胞。12.一种转基因植物，其包含权利要求1、2或3的重组核酸分子。13.权利要求12的植物，其中所述植物选自玉米、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油菜。14.一种转基因种子，其包含权利要求1、2或3的重组核酸分子。15.一种重组多肽，其包含HPPD蛋白，其中所述HPPD蛋白能耐受HPPD抑制剂除草剂，并且其中所述HPPD蛋白在对应于SEQIDNO:1的第335位氨基酸位置的氨基酸位置处包含脯氨酸，并且在对应于SEQIDNO:1的第336位氨基酸位置的氨基酸位置处包含苯丙氨酸或酪氨酸。16.权利要求15的重组多肽，其中所述HPPD蛋白还包含：i.在对应于SEQIDNO:1的第188位氨基酸位置的氨基酸位置处的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸；以及ii.在对应于SEQIDNO:1的第189位氨基酸位置的氨基酸位置处的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：F·波雷，B·雷伯，G·朗格，M·杜巴德，R·阿姆斯特朗，
申请(专利权)人：拜耳作物科学股份公司，拜耳作物科学有限合伙公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE