HPPD变体和使用方法技术

在本发明专利技术中，描述了显示针对若干类别的HPPD‑抑制剂的完全耐受性的HPPD酶和含有这些酶的植物。已设计一组不具有与HPPD抑制剂的亲和力或仅具有显著减小的亲和力的HPPD酶，并且同时HPPD抑制剂与该酶的解离速率增加至一定程度，以使得这些HPPD抑制剂不再用作缓慢结合或缓慢且紧密结合的抑制剂，而是与此相反地变成完全可逆的抑制剂。具体地说，提供了编码HPPD抑制剂耐受性多肽的分离多核苷酸。另外，包括与这些多肽相对应的氨基酸序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请是2014年3月11日提交的美国临时申请号61/951,455的PCT申请，该申请的内容通过引用以其整体结合在此。对以电子方式提交的序列表的引用经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交序列表的正式文本，其中文件名称是“APA146008ST25”，在2015年3月9日创建并且具有138千字节的大小。此序列表与本说明书同时提交。在此ASCII格式的文档中含有的序列表是本说明书的一部分并且通过引用以其整体结合在此。专利
本专利技术涉及植物分子生物学，具体地说是赋予提高的对HPPD抑制剂除草剂的耐受性的新型HPPD多肽。专利技术背景4-羟苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)是催化其中一种酪氨酸降解产物对-羟基苯丙酮酸(在此缩写为HPP)转化成生育酚和质体醌在植物中的前体尿黑酸(在此缩写为HG)的反应的酶(克劳奇N.P.(CrouchN.P.)等人(1997)，四面体(Tetrahedron)，53,20,6993-7010，弗里茨(Fritze)等人，(2004)，植物生理学(PlantPhysiology)134:1388-1400)。生育酚用作膜相关抗氧化剂。质体醌首先用作PSII与细胞色素b6/f复合物之间的电子载体，并且其次是作为参与类葫萝卜素生物合成的八氢番茄红素去饱和酶的氧化还原辅因子。至今，在NCBI数据库中存在的来自不同生物体的超过1000种核酸序列被标注为编码具有HPPD结构域的推定蛋白质。但是对于这些核酸序列中的大部分，还未证实该蛋白质在体外测定或植物方法中具有HPPD酶促活性，也未证实此HPPD蛋白当在植物中表达时能够赋予对HPPD抑制剂除草剂的除草剂耐受性。在现有
中已描述了若干种HPPD蛋白及其基本序列，具体地说是以下各项的HPPD蛋白：细菌，诸如假单胞菌属(瑞奇(Rüetschi)等人，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)，205,459-466,1992,WO96/38567)、克罗地亚属(Kordia)(WO2011/076889)、聚球藻属(WO2011/076877)、以及红球菌属(WO2011/076892)；原生生物诸如赭纤虫属(WO2011/076882)；广古菌门诸如嗜酸菌属(WO2011/076885)；植物诸如拟南芥属(WO96/38567，AF047834)、胡萝卜(WO96/38567，87257)、燕麦(WO2002/046387、WO2011/068567)、小麦(WO2002/046387)、臂形草(WO2002/046387)、蒺藜草(Cenchrusechinatus)(WO2002/046387)、硬直黑麦草(WO2002/046387)、苇状羊茅(WO2002/046387)、大狗尾草(WO2002/046387)、牛筋草(Eleusineindica)(WO2002/046387)、高粱(WO2002/046387、WO2012/021785)、玉米(WO2012/021785)、球孢子菌属(Coccicoide)(COITRP)；日本黄连(Coptisjaponica)(WO2006/132270)、莱茵衣藻(ES2275365；WO2011/145015)；或者哺乳动物诸如小鼠或猪。HPPD的抑制导致光合作用的解偶联、辅助性集光色素的缺乏并且最重要的是导致UV-辐射和活性氧(漂白)对叶绿素的破坏(由于缺乏类葫萝卜素通常所提供的光保护)(诺里斯(Norris)等人(1995)，植物细胞(PlantCell)7:2139-2149)。光合活性组织的漂白导致生长抑制和植物死亡。抑制HPPD的一些分子和在特异性结合该酶时抑制HPP到尿黑酸的转化的一些分子已证实是非常有效的除草剂。目前，大部分可商购获得的HPPD抑制剂除草剂属于以下这些化学剂家族中的一种：1)三酮类，例如磺草酮[即2-[2-氯-4-(甲磺酰基)苯甲酰基]-1,3-环己二酮]、甲基磺草酮[即2-[4-(甲磺酰基)-2-硝基苯甲酰基]-1,3-环己二酮]；氟磺草酮(tembotrione)[即2-[2-氯-4-(甲磺酰基)-3-[(2,2,2-三-氟乙氧基)甲基]苯甲酰基]-1,3-环-己二酮]；特呋三酮(tefuryltrione)[即2-[2-氯-4-(甲磺酰基)-3-[[(四氢-2-呋喃基)甲氧基]甲基]苯甲酰基]-1,3-环己二酮]]；双环吡喃酮[即4-羟基-3-[[2-[(2-甲氧基乙氧基)甲基]-6-(三氟甲基)-3-吡啶基]羰基]双环[3.2.1]辛-3-烯-2-酮]；苯并双环酮[即3-(2-氯-4-甲磺酰苯甲酰基)-2-苯基硫代双环[3.2.1]辛-2-烯-4-酮]；2)二酮腈类，例如2-氰基-3-环丙基-1-(2-甲基磺酰基-4-三氟甲基苯基)-丙烷-1,3-二酮和2-氰基-1-[4-(甲基磺酰基)-2-三氟甲基苯基]-3-(1-甲基环丙基)丙烷-1,3-二酮；3)异噁唑类，例如异噁唑草酮[即(5-环丙基-4-异噁唑基)[2-(甲磺酰基)-4-(三氟甲基)苯基]甲酮]；在植物中，异噁唑草酮以一种展现出HPPD抑制特性的二酮腈化合物DKN形式快速代谢；4)吡唑特(pyrazolinate)类，例如苯吡唑草酮[即[3-(4,5-二氢-3-异噁唑基)-2-甲基-4-(甲磺酰基)苯基](5-羟基-1-甲基-1H-吡唑-4-基)甲酮]和磺酰草吡唑[即(5-羟基-1,3-二甲基吡唑-4-基(2-甲磺酰-4-三氟甲基苯基)甲酮]；节草唑(pyrazofen)[即2-[4-(2,4-二氯苯甲酰基)-1,3-二甲基吡唑-5-基氧基]苯乙酮]；5)N(1,2,5-噁二唑-3-基)苯酰胺类(WO2011/035874)和N-(1,3,4-噁二唑-2-基)苯酰胺类(WO2012/126932)，例如2-甲基-N-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-3-(甲磺酰基)-4-(三氟甲基)苯酰胺(在下文中也称为“Cmpd.1”)；6)N-(四唑-5-基)-或N-(三唑-3-基)芳基甲酰胺类(WO2012/028579)，例如2-氯-3-乙氧基-4-(甲磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑-5-基)苯酰胺(在下文中也称为“Cmpd.2”)；4-(二氟甲基)-2-甲氧基-3-(甲磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑-5-基)苯酰胺(在下文中也称为“Cmpd.3”)；2-氯-3-(甲基硫烷基)-N-(1-甲基-1H-四唑-5-基)-4-(三氟甲基)苯酰胺(在下文中也称为“Cmpd.4”)；2-(甲氧基甲基)-3-(甲基亚磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑-5-基)-4-(三氟甲基)苯酰胺(在下文中也称为“Cmpd.5”)；7)在WO2013/050421和WO2013/083774中描述的哒嗪酮衍生物类；8)在WO2013/072300和WO2013/072402中描述的取代的1,2,5-噁二唑类；以及9)在WO2013/054495中描述的奥沙普秦(Oxoprazin)衍生物类。可以针对在显示代谢耐受性的农作物的田地中的青草和/或宽叶杂草使用这些HPPD抑制剂除草剂，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组核酸分子，编码由氨基酸序列组成的4‑羟苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)蛋白，该氨基酸序列包含在与SEQ ID NO:1的氨基酸位置335相对应的氨基酸位置处的脯氨酸和在与SEQ ID NO:1的氨基酸位置336相对应的位置处的苯丙氨酸或酪氨酸，并且其中所述HPPD蛋白对HPPD抑制剂除草剂耐受，其中所述编码的HPPD蛋白由进一步包含以下各项的氨基酸序列组成：(a)在与SEQ ID NO:1的氨基酸位置188相对应的氨基酸位置处的丙氨酸、在与SEQ ID NO:1的氨基酸位置226相对应的氨基酸位置处的组氨酸、以及在与SEQ ID NO:1的氨基酸位置340相对应的位置处的甘氨酸；(b)在与SEQ ID NO:1的氨基酸位置200相对应的氨基酸位置处的异亮氨酸、在与SEQ ID NO:1的氨基酸位置226相对应的氨基酸位置处的组氨酸、以及在与SEQ ID NO:1的氨基酸位置340相对应的位置处的甘氨酸；(c)在与SEQ ID NO:1的氨基酸位置226相对应的氨基酸位置处的组氨酸、以及在与SEQ ID NO:1的氨基酸位置340相对应的位置处的甘氨酸；(d)在与SEQ ID NO:1的氨基酸位置172相对应的氨基酸位置处的甘氨酸、以及在与SEQ ID NO:1的氨基酸位置340相对应的位置处的甘氨酸；(e)在与SEQ ID NO:1的氨基酸位置200相对应的氨基酸位置处的异亮氨酸、以及在与SEQ ID NO:1的氨基酸位置340相对应的位置处的甘氨酸；或者(f)在与SEQ ID NO:1的氨基酸位置188相对应的氨基酸位置处的丙氨酸、在与SEQ ID NO:1的氨基酸位置200相对应的氨基酸位置处的异亮氨酸、在与SEQ ID NO:1的氨基酸位置226相对应的氨基酸位置处的组氨酸、以及在与SEQ ID NO:1的氨基酸位置340相对应的位置处的甘氨酸。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.11 US 61/951,4551.一种重组核酸分子，编码由氨基酸序列组成的4-羟苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)蛋白，该氨基酸序列包含在与SEQIDNO:1的氨基酸位置335相对应的氨基酸位置处的脯氨酸和在与SEQIDNO:1的氨基酸位置336相对应的位置处的苯丙氨酸或酪氨酸，并且其中所述HPPD蛋白对HPPD抑制剂除草剂耐受，其中所述编码的HPPD蛋白由进一步包含以下各项的氨基酸序列组成：(a)在与SEQIDNO:1的氨基酸位置188相对应的氨基酸位置处的丙氨酸、在与SEQIDNO:1的氨基酸位置226相对应的氨基酸位置处的组氨酸、以及在与SEQIDNO:1的氨基酸位置340相对应的位置处的甘氨酸；(b)在与SEQIDNO:1的氨基酸位置200相对应的氨基酸位置处的异亮氨酸、在与SEQIDNO:1的氨基酸位置226相对应的氨基酸位置处的组氨酸、以及在与SEQIDNO:1的氨基酸位置340相对应的位置处的甘氨酸；(c)在与SEQIDNO:1的氨基酸位置226相对应的氨基酸位置处的组氨酸、以及在与SEQIDNO:1的氨基酸位置340相对应的位置处的甘氨酸；(d)在与SEQIDNO:1的氨基酸位置172相对应的氨基酸位置处的甘氨酸、以及在与SEQIDNO:1的氨基酸位置340相对应的位置处的甘氨酸；(e)在与SEQIDNO:1的氨基酸位置200相对应的氨基酸位置处的异亮氨酸、以及在与SEQIDNO:1的氨基酸位置340相对应的位置处的甘氨酸；或者(f)在与SEQIDNO:1的氨基酸位置188相对应的氨基酸位置处的丙氨酸、在与SEQIDNO:1的氨基酸位置200相对应的氨基酸位置处的异亮氨酸、在与SEQIDNO:1的氨基酸位置226相对应的氨基酸位置处的组氨酸、以及在与SEQIDNO:1的氨基酸位置340相对应的位置处的甘氨酸。2.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述HPPD蛋白包含与SEQIDNO1、5或6中所列出的氨基酸序列具有至少53％序列一致性的氨基酸序列。3.如权利要求1或2所述的重组核酸分子，其中其核苷酸序列是一种已设计用于在植物中表达的合成序列。4.如权利要求1-3中任一项所述的重组核酸分子，其中其核苷酸序列可操作地连接至能够指导该核苷酸序列在植物细胞中的表达的启动子。5.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列是选自下组，该组由SEQIDNO:40、41、42、43、44、以及45组成。6.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述HPPD抑制剂除草剂是选自下组，该组由以下各项组成：N(1,2,5-噁二唑-3-基)苯酰胺类；N-(四唑-4-基)-或N-(三唑-3-基)芳基甲酰胺类、N-(1,3,4-噁二唑-2-基)苯酰胺类、N-(四唑-5-基)-或N-(三唑-3-基)芳基甲酰胺类、哒嗪酮衍生物类、取代的1,2,5-噁二唑类、奥沙普秦衍生物类、三酮类、异噁唑类、以及吡唑特类。7.如权利要求6所述的重组核酸分子，其中所述HPPD抑制剂除草剂是选自下组，该组由以下各项组成：2-氯-3-乙氧基-4-(甲磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑-5-基)苯甲酰和2-氯-3-(甲氧基甲基)-4-(甲磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑-5-基)苯甲酰、2-甲基-N-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-3-(甲磺酰基)-4-(三氟甲基)苯甲酰、2-氯-3-乙氧基-4-(甲磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑-5-基)苯甲酰、4-(二氟甲基)-2-甲氧基-3-(甲磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑-5-基)苯甲酰、2-氯-3-(甲基硫烷基)-N-(1-甲基-1H-四唑-5-基)-4-(三氟甲基)苯甲酰、2-(甲氧基甲基)-3-(甲基亚磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑-5-基)-4-(三氟甲基)苯甲酰、氟磺草酮、磺草酮、甲基磺草酮、异噁唑草酮、磺酰草吡唑、以及苯吡唑草酮。8.一种宿主细胞，含有如权利要求1、2或4所述的重组核酸分子。9.如权利要求8所述的宿主细胞，是一种细菌宿主细胞。10.如权利要求8所述的宿主细胞，是一种植物细胞。11.一种转基因植物，包含如权利要求1-5中任一项所述的重组核酸分子。12.如权利要求11所述的植物，其中所述植物是选自下组，该组由以下各项组成：玉蜀黍、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、以及油菜。13.一种转基因种子，包含如权利要求1-5中任一项所述的重组核酸分子。14.一种构成HPPD蛋白的重组多肽，其中所述HPPD蛋白对HPPD抑制剂除草剂耐受，并且其中所述HPPD蛋白包含在与SEQIDNO:1的氨基酸位置335相对应的氨基酸位置处的脯氨酸和在与SEQIDNO:1的氨基酸位置336相对应的位置处的苯丙氨酸或酪氨酸，其中所述HPPD蛋白进一步包含(a)在与SEQIDNO:1的氨基酸位置188相对应的氨基酸位置处的丙氨酸、在与SEQIDNO:1的氨基酸位置226相对应的氨基酸位置处的组氨酸、以及在与SEQIDNO:1的氨基酸位置340相对应的位置处的甘氨酸；(b)在与SEQIDNO:1的氨基酸位置200相对应的氨基酸位置处的异亮氨酸、在与SEQIDNO:1的氨基酸位置226相对应的氨基酸位置处的组氨酸、以及在与SEQIDNO:1的氨基酸位置340相对应的位置处的甘氨酸；(c)在与SEQIDNO:1的氨基酸位置226相对应的氨基酸位置处的组氨酸、以及在与SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：M杜鲍尔德，R阿姆斯特朗，F波雷，C彼得斯，
申请(专利权)人：拜耳作物科学有限合伙公司，拜耳作物科学股份公司，
类型：发明
国别省市：美国;US