新型类芽孢杆菌属菌株、抗真菌化合物以及它们的使用方法技术

本发明专利技术涉及包含杀真菌的类芽孢杆菌属种菌株的生物纯的培养物的组合物，所述菌株包含在第三模块中缺少功能性腺苷酰化结构域的变体杀镰孢菌素合成酶。本发明专利技术还提供了包含杀真菌的类芽孢杆菌属种菌株的生物纯的培养物或其无细胞提取物的组合物，所述生物纯的培养物或无细胞提取物包括至少一种Paeniserine和至少一种Paeniprolixin。还提供了分离的化合物以及用所公开的组合物和化合物处理植物以防治植物病害的方法。治植物病害的方法。治植物病害的方法。

【技术实现步骤摘要】
新型类芽孢杆菌属菌株、抗真菌化合物以及它们的使用方法
[0001]本申请是2016年3月23日提交的申请号为PCT/US2016/023760、专利技术名称为“新型类芽孢杆菌属菌株、抗真菌化合物以及它们的使用方法”的国际申请的分案申请，所述国际申请于2017年11月24日进入中国国家阶段，其申请号为201680030395.7。
[0002]相关申请的交叉引用
[0003]本申请要求提交于2015年3月26日的美国临时专利申请号62/138,765和提交于2015年9月24日的美国临时专利申请号62/232,205的优先权，所述临时专利申请的内容皆以引用的方式全文纳入本文。
[0004]电子方式提交的序列表的引用
[0005]序列表的正式副本通过EFS
‑
Web、作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，其文件名为“BCS 159002WO_ST25.txt”，创建于2016年3月21日，大小为68千字节，序列表的正式副本与说明书共同提交。该ASCII格式的文件中包含的序列表是说明书的一部分，并且以引用的方式全文纳入本文。


[0006]本专利技术涉及细菌菌株和它们防治植物病害的能力的领域。具体而言，本专利技术涉及具有相对高水平的广谱抗真菌活性的类芽孢杆菌属种(Paenibacillus sp.)菌株。

技术介绍

[0007]杀真菌剂具有众多用途，包括用于作物保护；作为食品、饲料和化妆品防腐剂；以及作为用于人和兽医应用的治疗剂。在发达国家和发展中国家均存在作物减产、食物传播的疾病以及人和动物的真菌感染的问题。
[0008]合成杀虫剂或杀真菌剂通常是非特异性的，因此可作用于靶生物体以外的生物体，包括其他天然存在的有益的生物体。由于它们的化学性质，它们也可能是有毒的和非生物可降解的。全世界的消费者越来越意识到与化学品残留相关的潜在环境问题和健康问题，特别是在食品产品中。这已经导致针对减少化学(即合成)农药的使用或至少减少其数量的不断增加的消费者压力。因此，需要管理食物链需求，同时仍允许有效的害虫防治。
[0009]另一个随着合成杀虫剂或杀真菌剂的使用而出现的问题是，重复和单独施用杀虫剂或杀真菌剂通常导致对抗性病原微生物的选择。通常，这样的菌株还对其他具有相同作用模式的活性成分具有交叉抗性。之后，使用所述活性化合物来有效防治病原体将不再可能。然而，具有新作用机制的活性成分难以开发并且开发成本高。
[0010]病原体种群中抗性发展的风险以及对环境和人健康的担忧促进了对鉴定用于管理植物病害的合成杀虫剂和杀真菌剂的替代方案的兴趣。生物防治剂的使用是一种替代方案。
[0011]非核糖体肽(例如杀镰孢菌素(fusaricidin))的抗微生物特性是公认的，并且已用于作物保护领域。由于它们的作用模式，它们还在生物医药和其他生物技术应用中具有潜在的用途。杀镰孢菌素可分离自类芽孢杆菌属种，并且具有环结构，该结构由6个氨基酸
残基及15
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胍基
‑3‑
羟基十五酸组成。分离自多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)的杀镰孢菌素包括LI
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F03、LI
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F04、LI
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F05、LI
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F07和LI
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F08(Kurusu K,Ohba K,Arai T and Fukushima K.,J.Antibiotics,40:1506
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1514,1987)，并且已报道其他的杀镰孢菌素A、B、C和D(Kajimura Y and Kaneda M.,J.Antibiotics,49:129
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135,1996；Kajimura Y and Kaneda M.,J.Antibiotics,50:220
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228,1997)。
[0012]已知某些杀镰孢菌素具有针对植物致病真菌例如尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)和托姆青霉(Penicillium thomii)的杀菌活性。一些杀镰孢菌素还具有针对革兰氏阳性细菌，包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的杀菌活性(Kajimura Y and Kaneda M.,J.Antibiotics,49:129
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135,1996；Kajimura Y and Kaneda M.,J.Antibiotics,50:220
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228,1997)。此外，已发现特定的杀镰孢菌素具有针对引起加拿大油菜的黑根腐病的斑点小球腔菌(Leptosphaeria maculans)的抗真菌活性(Beatty PH and Jensen SE.,Can.J.Microbiol.,48:159
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169,2002)。需要进一步表征杀镰孢菌素化合物，并鉴定产生那些以相对低的施用率提供广谱抗真菌活性的杀镰孢菌素的类芽孢杆菌属种的菌株。
[0013]杀镰孢菌素和其他抗真菌代谢物可通过类芽孢杆菌属种的发酵获得。然而，许多类芽孢杆菌属种菌株还产生被称为多粘菌素(polymyxin)的抗生素。多粘菌素选择性地对革兰氏阴性细菌具有毒性，并且当给予人类患者时可具有神经毒性和肾毒性作用。增加的抗微生物抗性的全球性问题和多粘菌素的相对毒性要求谨慎的使用和施用这些抗生素。由于这个原因，非常需要被开发用于农业的类芽孢杆菌属种菌株表达相对高水平的杀镰孢菌素并且不表达可检测的多粘菌素。这样的菌株对工人和消费者几乎没有造成风险或没有造成风险。此外，需要鉴定表现出广谱活性的类芽孢杆菌属种菌株。非常需要改善现有杀真菌剂的功效，特别是不易受到真菌抗性发展的影响的那些杀真菌剂。

技术实现思路

[0014]本专利技术涉及包括杀真菌的类芽孢杆菌属种菌株的生物纯的培养物的组合物，该菌株包含在第三模块中缺少功能性腺苷酰化结构域(FusA
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A3)的变体杀镰孢菌素合成酶，其中与包含野生型杀镰孢菌素合成酶的类芽孢杆菌属种菌株的杀镰孢菌素合成相比，功能性FusA
‑
A3的缺失抑制在氨基酸残基(3)处具有酪氨酸或苯丙氨酸的杀镰孢菌素的合成。在某些方面，变体杀镰孢菌素合成酶在FusA
‑
A3中包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、或10个决定底物特异性的氨基酸残基的缺失。在其他方面，氨基酸残基选自Asp235、Ala236、Ser239、Thr278、Leu299、Ala301、Ala/Gly322、Val330、Cys331、Lys517或其组合。
[0015]在一个实施方案中，氨基酸残基位于SEQ ID NO:11的第3203、3204、3207、3246、3267、3269、3290、3298、3299本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种组合物，其包括杀真菌的类芽孢杆菌属种菌株的生物纯的培养物，所述菌株包含在第三模块中缺少功能性腺苷酰化结构域(FusA
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A3)的变体杀镰孢菌素合成酶，其中与包含野生型杀镰孢菌素合成酶的类芽孢杆菌属种菌株的杀镰孢菌素合成相比，功能性FusA
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A3的缺失抑制杀镰孢菌素的合成，所述杀镰孢菌素在氨基酸残基(3)处具有酪氨酸或苯丙氨酸；并且其中所述变体杀镰孢菌素合成酶在FusA
‑
A3中包含对应于以下位置的氨基酸残基的缺失：SEQ ID NO:1的Asp254、Ala255、Ser258、Thr297、Leu318、Ala320、Gly341、Val349和Cys350；或SEQ ID NO:9的Asp254、Ala255、Ser258、Thr297、Leu318、Ala320、Ala341、Val349和Cys350；或SEQ ID NO:11的Asp254、Ala255、Ser258、Thr297、Leu318、Ala320、Gly 341、Ile349和Cys350。2.权利要求1的组合物，其中所述变体杀镰孢菌素合成酶还包含显示出与SEQ ID NO:10至少90％序列同一性的氨基酸序列。3.权利要求1的组合物，其中所述变体杀镰孢菌素合成酶包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。4.权利要求1的组合物，其包括杀真菌的类芽孢杆菌属种菌株的生物纯的培养物或其无细胞提取物，所述生物纯的培养物或无细胞提取物包括至少一种Paeniserine和至少一种Paeniprolixin。5.权利要求4的组合物，其中所述至少一种Paeniserine选自Paeniserine A1、Paeniserine A2、Paeniserine A3、Paeniserine A4、Paeniserine B1、Paeniserine B2、Paeniserine B3、Paeniserine B4、Paeniserine C1、Paeniserine C2和Paeniserine C3。6.权利要求4或5的组合物，其中所述至少一种Paeniprolixin选自Paeniprolixin A1、Paeniprolixin A2、Paeniprolixin B1、Paeniprolixin B2、Paeniprolixin C1、Paeniprolixin D1、Paeniprolixin E1、Paeniprolixin E2、Paeniprolixin F1、Paeniprolixin F2、Paeniprolixin G1和Paeniprolixin G2。7.权利要求4至6中任一项的组合物，其中所述组合物包括杀镰孢菌素A、LiF08a；Paeniserine A1、Paeniserine B1、Paeniprolixin A2和Paeniprolixin B2。8.权利要求4至7中任一项的组合物，其中所述组合物不包括LiF03a、LiF03b、LiF03c、LiF03d、LiF07a、LiF07b、LiF07c和/或LiF07d。9.权利要求4至8中任一项的组合物，其包括协同有效量的Paeniserine A1、Paeniserine B1、Paeniprolixin A2和Paeniprolixin B2。10.权利要求9的组合物，其中所述(a)Paeniserine A1和Paeniserine B1以及(b)Paeniprolixin A2和Paeniprolixin B2的(a):(b)重量比为约500:1至约1:500、约250:1至约1:250、约100:1至约1:100、约50:1至约1:50、约10:1至1:10、或约5:1至约1:5。11.权利要求9的组合物，其中所述(a):(b)重量比为约1:1。12.权利要求1至11中任一项的组合物，其中所述类芽孢杆菌属种菌株是类芽孢杆菌属种菌株NRRL B
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50972、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B
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67129或其杀真菌突变菌株。13.权利要求12的组合物，其包括类芽孢杆菌属种菌株NRRL B
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50972、类芽孢杆菌属...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：拜耳作物科学有限合伙公司，
类型：发明
国别省市：