高产D-泛酸的基因工程菌、构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种高产D

【技术实现步骤摘要】
高产D
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泛酸的基因工程菌、构建方法及应用


[0001]本专利技术涉及一种高产D
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泛酸的基因工程菌、构建方法及应用。

技术介绍

[0002]在自然界中，泛酸主要存在两种构型：D
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泛酸和L
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泛酸。在生物体内只有D
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泛酸具有生物活性。D
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泛酸（D
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Pantothenic Acid）又称维生素B5，属于维生素B族水溶性维生素，广泛存在于多种食物中，是人体必需的13种维生素之一。D
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泛酸在生物体内可作为辅酶A（CoA）的前体，在几乎所有的生物过程中均发挥着关键作用，推动生物体内的能源代谢和能量交换。泛酸的磷酸化产物巯基乙胺可以合成4
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磷酸泛酰巯基乙胺，为辅酶A（CoA）及酰基载体蛋白（ACP） 的组成部分，而CoA及ACP作为构成酰基转移酶的辅酶，广泛参与糖、脂类、蛋白质代谢及肝脏的生物转化作用，对生物体的生长能够起到显著的促进作用。当前发现泛酸只能由植物和微生物合成，动物不能合成泛酸，只能从外界摄取，因此D
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泛酸在医药行业、食品工业和饲料工业中的应用有较大潜力。
[0003]目前D
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泛酸的生产主要有三种方法：化学合成拆分法，生物拆分法以及生物发酵法。化学合成拆分法主要通过两条途径生产D
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泛酸：1、以甲醛和异丁醛为起始原料，经醛缩合、腈化以及内酯化等反应生成DL
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泛解酸内酯，再进行化学拆分得到D
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泛解酸内酯，最后通过与β
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丙氨酸钙直接缩合得到D
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泛酸钙；2、通过DL
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泛解酸内酯与β
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丙氨酸钙合成DL
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泛酸钙后再诱导结晶，最后通过物理拆分法得到；生物拆分法使用D
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立体专一性内酯水解酶水解DL
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泛解酸内酯，得到D
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泛解酸，再经内酯化反应生成D
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泛解酸内酯，最后与β
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丙氨酸钙合成得到D
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泛酸钙；生物发酵法则是通过添加前体进行发酵，发酵葡萄糖生成D
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泛解酸，同时在发酵液中添加β
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丙氨酸，最后就可以直接得到D
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泛酸。
[0004]随着基因工程技术的发展，使用微生物产D
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泛酸因其优势日益受到了人们的广泛关注，但利用野生细菌发酵远远不能达到高产D
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泛酸的要求，因此需要通过代谢改造的方式来获得高产D
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泛酸的工程菌株。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种高产D
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泛酸的基因工程菌株及其构建方法，以及其在微生物发酵制备D
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泛酸中的应用。
[0006]本专利技术采用的技术方案是：高产D
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泛酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：（1）以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为底盘菌，将其基因组中的panB基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43
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panB）；（2）将工程菌Bacillus subtilis（P43
‑
panB）基因组中的panC基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43
‑
panBpanC）；（3）将工程菌Bacillus subtilis（P43
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panBpanC）基因组中的panD基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43
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panBpanCpanD）；
（4）将工程菌Bacillus subtilis（P43
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panBpanCpanD）基因组中的panE基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43
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panBpanCpanDpanE）；（5）将工程菌Bacillus subtilis（P43
‑
panBpanCpanDpanE）基因组中的ilvC基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43
‑
panBpanCpanDpanEilvC）；（6）将工程菌Bacillus subtilis（P43
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panBpanCpanDpanEilvC）基因组中的ilvD基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43
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panBpanCpanDpanEilvCilvD）；（7）将工程菌Bacillus subtilis（P43
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panBpanCpanDpanEilvCilvD）基因组中的serA基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43
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panBpanCpanDpanEilvCilvDserA）；（8）将工程菌Bacillus subtilis（P43
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panBpanCpanDpanEilvCilvDserA）基因组中的glyA基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43
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panBpanCpanDpanEilvCilvDserAglyA），即为所述的高产D
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泛酸的基因工程菌。
[0007]本专利技术通过使用来源于pP43NMK的P43启动子和RBS序列置换ilvC、ilvD基因的原有启动子，强化了泛酸合成途径中的α
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酮异戊酸生成量；通过使用来源于pP43NMK的P43启动子和RBS序列置换panB、panE基因的原有启动子，强化了泛解酸的合成；通过使用来源于pP43NMK的P43启动子和RBS序列置换panD基因的原有启动子，强化了β
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丙氨酸的合成。同时强化了glyA和serA基因的表达，增加胞内丝氨酸的水平，由此达到了高产D
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泛酸的目的。
[0008]本专利技术还涉及构建所述基因工程菌的方法，所述方法包括：（1）以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为底盘菌，运用Cre/loxP基因编辑系统将其基因组中的panB基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43
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panB）；（2）运用Cre/loxP基因编辑系统将工程菌Bacillus subtilis（P43
‑
panB）基因组中的panC基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.高产D
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泛酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：（1）以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为底盘菌，将其基因组中的panB基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43
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panB）；（2）将工程菌Bacillus subtilis（P43
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panB）基因组中的panC基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43
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panBpanC）；（3）将工程菌Bacillus subtilis（P43
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panBpanC）基因组中的panD基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43
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panBpanCpanD）；（4）将工程菌Bacillus subtilis（P43
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panBpanCpanD）基因组中的panE基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43
‑
panBpanCpanDpanE）；（5）将工程菌Bacillus subtilis（P43
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panBpanCpanDpanE）基因组中的ilvC基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43
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panBpanCpanDpanEilvC）；（6）将工程菌Bacillus subtilis（P43
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panBpanCpanDpanEilvC）基因组中的ilvD基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43
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panBpanCpanDpanEilvCilvD）；（7）将工程菌Bacillus subtilis（P43
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panBpanCpanDpanEilvCilvD）基因组中的serA基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43
‑
panBpanCpanDpanEilvCilvDserA）；（8）将工程菌Bacillus subtilis（P43
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panBpanCpanDpanEilvCilvDserA）基因组中的glyA基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43
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panBpanCpanDpanEilvCilvDserAglyA），即为所述的高产D
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泛酸的基因工程菌。2.构建权利要求1所述基因工程菌的方法，所述方法包括：（1）以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为底盘菌，运用Cre/loxP基因编辑系统将其基因组中的panB基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43
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panB）；（2）运用Cre/loxP基因编辑系统将工程菌Bacillus subtilis（P43
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panB）基因组中的panC基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43
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panBpa...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，吴梓丹，张博，杨辉，李世蓉，王丽芳，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：