一种高效表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的基因工程菌株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术涉及工业微生物技术领域，尤其是涉及一株高效表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的基因工程菌株及其构建方法和应用。本发明专利技术以P43启动子、含有来源于枯草芽孢杆菌OKB105的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因sfp以及来源于质粒pQE

【技术实现步骤摘要】
一种高效表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的基因工程菌株及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及工业微生物
，尤其是涉及一株高效表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的基因工程菌株及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]以猪流行性腹泻病毒为代表的囊膜病毒类传染病对畜牧业带来严峻挑战。目前我国养殖户在预防囊膜病毒疾病方面几乎束手无策，只能通过饲料中添加适量的“痢菌净”进行全群预防以及一些效果牵强的隔离免疫。一旦动物发病，往往需要在饲料中添加营养性抗应激的多维和广谱抗生素防止继发感染，造成大量的抗生素药物残留，制约了我国养殖业健康发展。随着国家饲料禁抗政策的全面落实，从预防角度开发新产品遏制囊膜病毒类疾病已成为行业的迫切需要。
[0003]生物表面活性素属于脂肽类化合物，由一个成环的七肽和一条脂肪链共价结合而成。七肽构成表面活性素较大的亲水端，而脂肪链作为表面活性素较小的疏水端，使其分子具备“倒锥形脂”的结构特点。倒锥形脂能够插入病毒囊膜，抑制囊膜病毒入侵宿主细胞时的膜融合过程，可以在囊膜病毒感染细胞早期发挥有效的抗病毒作用。
[0004]目前主要利用大肠杆菌实现生物表面活性素的工业化生产，但大肠杆菌无法应用于饲料添加，且生物表面活性素的表达量不高，亟需改进。目前主要通过蔗糖诱导的次级代谢产物、野生菌筛选或基因工程改造等方式来提高生物表面活性素的产量，但生物表面活性素的产量仍不理想。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一目的在于提供一株高效表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌株，该基因工程菌株能够大幅提高磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的相对表达量。
[0006]本专利技术的第二目的在于提供一种高效表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌株的构建方法。
[0007]本专利技术的第三目的在于提供一种高效表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌株在发酵生产磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶中的应用。
[0008]本专利技术提供的一种高效表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的基因工程菌株，以P43启动子、含有来源于枯草芽孢杆菌OKB105的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因sfp以及来源于质粒pQE
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30的rrnB T1终止子序列、来源于质粒pGJ103的含有复制起始位点的氯霉素抗性基因和来源于质粒pUZ8002的parDE基因构建重组质粒pSFP1作为表达载体，以含有sfp基因序列的枯草芽孢杆菌168为宿主菌构建得到的基因工程菌株。
[0009]枯草芽孢杆菌为传统的工业生产菌，其生产的生物表面活性素可以被直接分泌到菌体外，无需破坏细胞就可以获得大量生物表面活性素，显著降低了目标肽的生产成本。枯
草芽孢杆菌还是国家饲料添加剂目录许可的益生菌，其不含有内毒素，采用枯草芽孢杆菌表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶并生产生物表面活性素具有很大优势。
[0010]磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（sfp）是合成生物表面活性素的关键酶，其通过催化非核糖体肽和载铁蛋白前体的形成，进而激活生物表面活性素合成酶，实现生物表面活性素的合成。本专利技术通过控制磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的表达量进而影响生物表面活性素的产量。
[0011]优选地，所述宿主菌由枯草芽孢杆菌168改造得到，其改造方法为：步骤1.PCR扩增pJOE8999质粒；步骤2.化学合成含pJOE8999质粒同源臂的gRNA序列；步骤3.将步骤1扩增的pJOE8999质粒序列与步骤2合成的gRNA序列连接，获得完整质粒进行大肠杆菌转化，繁殖后提取获得pJOE8999
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gRNA质粒；步骤4.化学合成含有P43启动子序列
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sfp基因序列
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终止子序列的供体DNA重组大片段；步骤5.将步骤3得到的重组质粒pJOE8999
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gRNA与步骤4得到的供体DNA重组大片段共同转化入枯草芽孢杆菌168中，培养筛选得到完全丢pJOE8999
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gRNA质粒的转化子，获得宿主菌
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枯草芽孢杆菌168
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SFP。
[0012]本专利技术还提供了一种基因工程菌株的构建方法，包括以下步骤：（1）构建重组表达载体pSFP1，包括以下步骤：a.以枯草芽孢杆菌168的基因组DNA为模板，PCR扩增其P43启动子；b.以枯草芽孢杆菌OKB105基因组DNA为模板，PCR扩增获得磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因sfp；c.连接P43启动子序列与sfp基因获得序列A1；d.由质粒pQE
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30中PCR扩增获得rrnB T1终止子序列并与序列A1连接获得序列A2；e.由质粒pGJ103中PCR扩增获得含氯霉素抗性基因且含有复制起始位点的基因序列并与序列A2连接获得序列A3；f.由质粒pUZ8002中PCR扩增获得parDE基因，并与序列A3连接获得重组表达载体pSFP1；（2）将重组表达载体pSFP1转化到所述宿主菌，从而获得基因工程菌株。
[0013]优选地，所述P43启动子的序列如SEQ ID NO：1所示。
[0014]优选地，步骤a中PCR扩增的反应体系如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；之后72℃延伸10min。
[0015]优选地，步骤b中PCR扩增的反应体系如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸40s，共30个循环；之后72℃延伸10min。
[0016]优选地，步骤d中的PCR扩增的反应体系如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；之后72℃延伸10min。
[0017]优选地，步骤e中的PCR扩增的反应体系如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环；之后72℃延伸10min。
[0018]优选地，步骤f中的PCR扩增的反应体系如下：95℃预变性5min；95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸1min，共30个循环；之后72℃延伸10min。
[0019]本专利技术还提供了本专利技术所述的高效表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的基因工程菌株在发酵生产磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶中的应用。
[0020]有益效果：本专利技术以枯草芽孢杆菌为表达宿主，实现了枯草芽孢杆菌OKB105来源的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的高效表达，重组磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的相对表达量与现有改造得到的菌株相比提高56倍，简化了生产工艺流程且明显降低了生产费用。本专利技术的表达水平已达到工业化生产要求。
附图说明
[0021]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的基因工程菌株，其特征在于，以P43启动子、含有来源于枯草芽孢杆菌OKB105的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因sfp以及来源于质粒pQE
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30的rrnB T1终止子序列、来源于质粒pGJ103的含有复制起始位点的氯霉素抗性基因和来源于质粒pUZ8002的parDE基因构建重组质粒pSFP1作为表达载体，以含有sfp基因序列的枯草芽孢杆菌168为宿主菌构建得到的基因工程菌株。2.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述宿主菌由枯草芽孢杆菌168改造得到，其改造方法为：步骤1.PCR扩增pJOE8999质粒；步骤2.化学合成含pJOE8999质粒同源臂的gRNA序列；步骤3.将步骤1扩增的pJOE8999质粒序列与步骤2合成的gRNA序列连接，获得完整质粒进行大肠杆菌转化，繁殖后提取获得pJOE8999
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gRNA质粒；步骤4.化学合成含有P43启动子序列
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sfp基因序列
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终止子序列的供体DNA重组大片段；步骤5.将步骤3得到的重组质粒pJOE8999
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gRNA与步骤4得到的供体DNA重组大片段共同转化入枯草芽孢杆菌168中，培养筛选得到完全丢pJOE8999
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gRNA质粒的转化子，获得宿主菌
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枯草芽孢杆菌168
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SFP。3.一种权利要求1
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2任一所述的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）构建重组表达载体pSFP1，包括以下步骤：a.以枯草芽孢杆菌168的基因组DNA为模板，PCR扩增其P43启动子；b.以枯草芽孢杆菌OKB105基因组DNA为模板，PCR扩增获得磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因sfp；c.连接P43启动子序列与sfp基因获得...

【专利技术属性】
技术研发人员：武刚，刘文庆，俞颖，薛虎平，张丽，李萍，胡海燕，陈玉玲，张甲戌，
申请(专利权)人：甘肃奥林贝尔生物工程研究院有限公司甘肃奥谱金肽生物工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：