高产β-烟酰胺单核苷酸的基因工程菌株及其构建与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高产β

【技术实现步骤摘要】
BL21(DE3)NadE(E.N)或E.coli BL21(DE3)pLysS NadE2(E.N2)或E.coli Rosetta(DE3)NadE3(E.N3)或E.coli BL21(DE3)PncB(E.P)或E.coli JM109(DE3)PncB(E.P2)或E.coli BL21(DE3)NadE
‑
PncB(E.NP)。
[0021]如上所述的基因工程的构建方法，其特征在于：步骤如下：
[0022]一、重组质粒的构建：
[0023]⑴
目的片段基因的获得：根据目的基因设计引物扩增，或者根据基因序列直接合成；根据NCBI查询得到的NadE酶基因设计引物序列NadE
‑
FF1/NadE
‑
RR1，在基因两端分别引入酶切位点；根据NCBI查询得到的PncB酶基因设计引物序列PncB
‑
FF1/PncB
‑
RR1，在基因两端分别引入酶切位点；PCR分别扩增Bacillus subtilis 168中NadE、PncB，Bacillus mycoides中PnuC基因根据基因序列直接合成；
[0024]根据NCBI查询得到的NadE酶基因设计引物序列NadE
‑
FF2/NadE
‑
RR2，在基因两端分别引入酶切位点；根据NCBI查询得到的PncB酶基因设计引物序列PncB
‑
FF2/PncB
‑
RR2，在基因两端分别引入酶切位点；PCR分别扩增大肠杆菌BL21中的NadE、PncB目的基因；
[0025]⑵
重组质粒的构建：将扩增的B.subtilis168中的NadE基因片段纯化回收后与单酶切后的质粒pMA5质粒使用非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒进行同源重组，得到重组产物质粒pMA5
‑
NadE；将扩增的B.subtilis168中的PncB基因片段纯化回收后与单酶切后的质粒pMA5质粒进行同源重组，得到重组产物质粒pMA5
‑
PncB；设计引物pP
‑
FF1/pP
‑
RR1，以重组质粒pMA5
‑
PncB为模板，扩增HpaⅡpromoter和PncB序列，将扩增的HpaⅡpromoter和PncB基因片段纯化回收后与单酶切后的质粒pMA5
‑
NadE质粒进行同源重组，得到重组产物质粒pMA5
‑
NadE
‑
PncB；用单酶切质粒pMA5
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PncB，将合成的Bacillus mycoides中的PnuC片段与单酶切后的质粒pMA5
‑
PncB同源重组，得到重组质粒pMA5
‑
PncB
‑
PnuC；
[0026]用内切酶单酶切载体质粒pET22b，将扩增的E.coli BL21的NadE基因片段纯化回收后与单酶切后的质粒pET22b质粒进行同源重组，得到重组质粒pET22b
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NadE，用内切酶单酶切质粒pET22b
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NadE，将扩增的E.coli BL21中的PncB基因片段纯化回收后与单酶切后的质粒pET22b
‑
NadE质粒进行同源重组，得到重组质粒pET22b
‑
NadE
‑
PncB；
[0027]二、过表达基因工程菌株的构建：
[0028]将构建的重组质粒分别转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过菌落PCR验证，筛选大肠杆菌DH5α阳性转化子，于含有抗生素的LB液体培养基中，30～37℃恒温震荡过夜培养，
‑
80℃保存菌种备用；提取大肠杆菌DH5α阳性转化子中的重组质粒，将提取得到的重组质粒转化至B.subtilis或E.coli底盘菌株中，涂布于含有抗生素的抗性平板中，进行菌落PCR验证，挑选B.subtilis或E.coli菌株中的阳性转化子于含有抗生素的液体培养基中，37℃恒温震荡过夜培养，
‑
80℃保存菌种备用，得到高产β
‑
烟酰胺单核苷酸基因工程菌株。
[0029]一种重组载体，所述载体含有如权利要求1至6任一项所述的基因工程菌株的氨基酸序列。
[0030]如上所述的基因工程菌株在β
‑
烟酰胺单核苷酸生产方面中的应用。
[0031]利用如上所述的基因工程菌株生产β
‑
烟酰胺单核苷酸的方法，步骤如下：
[0032]通过发酵培养所述高产β
‑
烟酰胺单核苷酸基因工程菌株，从发酵液中提取β
‑
烟酰胺单核苷酸。
[0033]进一步地，发酵培养时的发酵培养基碳源为甘油或葡萄糖，氮源为蛋白胨或酵母
提取物，培养温度为30
‑
37℃；
[0034]或者，提取β
‑
烟酰胺单核苷酸使用反相高效液相色谱制备柱纯化，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶。
[0035]本专利技术取得的有益效果是：
[0036]1、本专利技术基因工程菌是以枯草芽孢杆菌或大肠杆菌为底盘菌株，在底盘菌株中至少过表达NAD
+
合成酶NadE、烟酸磷酸核糖基转移酶PncB与转运蛋白PnuC其中的一个基因获得的，从而实现微生物发酵高产β
‑
烟酰胺单核苷酸。
[0037]2、本专利技术方法是通过构建过表达NAD
+
合成酶NadE、烟酸磷酸核糖基转移酶PncB、转运蛋白PnuC的基因工程菌株，以葡萄糖或甘油等廉价原料发酵生产β
‑
烟酰胺单核苷酸的新方法。
[0038]3、本专利技术方法中无需额外添加ATP、烟酰胺等昂贵原料，显著降低了生产成本。
[0039]4、本专利技术方法中NAD
+
合成酶NadE、烟酸磷酸核糖基转移酶PncB均来源于同源序列，无需考虑不同宿主之间其密码子的偏好性。
[0040]5、本专利技术不涉及有毒试剂，减少了环境污染，为后续纯化操作降低难度。
附图说明
[0041]图1为本专利技术中使用的pMA5质粒图谱；
[0042]图2为本专利技术中枯草芽孢杆菌中使用的重组质粒的构建图；其中：a为本专利技术中以pMA5为基础构建pMA5
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NadE重组质粒的构建图；b为本专利技术中以pMA5为基础构建pMA5
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PncB1重组质粒的构建图；c为本专利技术中以pMA5为基础构建pMA5
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PncB2重组质粒的构建图；d为本专利技术中以pMA5
‑
NadE为基础构建pMA5
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NadE
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PncB1重组质粒的构建图；e为本专利技术中以pMA5
‑
NadE为基础构建pMA5
‑
NadE
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产β
‑
烟酰胺单核苷酸的基因工程菌株，其特征在于：构建步骤如下：过表达NAD
+
合成酶基因NadE、烟酸磷酸核糖转移酶基因PncB和转运蛋白基因PnuC三种基因中的任意一个或两个或三个。2.根据权利要求1所述的高产β
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烟酰胺单核苷酸的基因工程菌株，其特征在于：所述基因工程菌株使用的底盘菌株包括枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母菌。3.根据权利要求2所述的高产β
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烟酰胺单核苷酸的基因工程菌株，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌包括B.subtilis 168、B.subtilis WB600、B.subtilis WB800；或者，所述大肠杆菌包括E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)pLysS、E.coli Rosetta(DE3)、E.coli JM109(DE3)；或者，构建时使用的过表达载体质粒包括pMA5、pWB980、pHT43、pHT01和pET22b、pET28a、pET30a、pUC57。4.根据权利要求1所述的高产β
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烟酰胺单核苷酸的基因工程菌株，其特征在于：过表达的NAD
+
合成酶基因NadE的氨基酸序列与序列SEQ ID No.1具有至少95％的一致性；或者，过表达的烟酸磷酸糖基转移酶基因PncB的氨基酸序列与序列SEQ ID No.2具有至少95％的一致性；或者，过表达的转运蛋白基因PnuC的氨基酸序列与序列SEQ ID No.3具有至少95％的一致性；或者，过表达NAD
+
合成酶基因NadE的氨基酸序列与序列SEQ ID No.4具有95％的一致性；或者，过表达的烟酸磷酸糖基转移酶基因PncB的氨基酸序列与序列SEQ ID No.5具有至少95％的一致性。5.根据权利要求1所述的高产β
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烟酰胺单核苷酸的基因工程菌株，其特征在于：所述基因工程菌株包括BacillussubtilisNadE(B.S.N)或Bacillus subtilis 168NadE1(B.S168.N1)、Bacillus subtilis PncB1(B.S.P1)或Bacillus subtilis PncB2(B.S.P2)或Bacillus subtilis WB800PncB(B.S800.P3)或Bacillus subtilis WB600PncB(B.S800.P4)、Bacillus subtilis NadE
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PncB1(B.S.PN1)或Bacillus subtilis NadE
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PncB2(B.S.PN2)或Bacillus subtilis PncB2
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PnuC(B.S.PP)或E.coli BL21(DE3)NadE(E.N)或E.coli BL21(DE3)pLysS NadE2(E.N2)或E.coli Rosetta(DE3)NadE3(E.N3)或E.coli BL21(DE3)PncB(E.P)或E.coli JM109(DE3)PncB(E.P2)或E.coli BL21(DE3)NadE
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PncB(E.NP)。6.如权利要求1所述的基因工程的构建方法，其特征在于：步骤如下：一、重组质粒的构建：
⑴
目的片段基因的获得：根据目的基因设计引物扩增，或者根据基因序列直接合成；根据NCBI查询得到的NadE酶基因设计引物序列NadE
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FF1/NadE
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RR1，在基因两端分别引入酶切位点；根据NCBI查询得到的PncB酶基因设计引物序列PncB
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FF1/PncB
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RR1，在基因两端分别引入酶切位点；PCR分别扩增Bacillus subtilis 168中NadE、PncB，Bacillus mycoides中Pnu...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭之磊，闫佳佳，王雁龙，许倍铭，周东浩，杨怡航，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：