本发明专利技术公开了一种烟草FLS基因在调控植物类黄酮代谢中的应用，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的NtFLS1合成酶基因和NtFLS2合成酶基因在调控植物类黄酮代谢中的应用。本发明专利技术前期研究烟草FLS基因功能时，在转化FLS基因过表达载体的烟草植株中发现一个FLS基因表达水平受到显著抑制的株系。本发明专利技术分析了烟草FLS基因表达受到抑制对类黄酮代谢的影响，为进一步研究烟草类黄酮代谢途径奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于遗传工程
，具体涉及一种烟草FLS基因在调控植物类黄酮代谢中的应用。
技术介绍
类黄酮是植物界广泛分布的次级代谢产物，通过苯丙烷途径进行合成。其合成以香豆酰CoA和丙二酰CoA为前体，在查尔酮合酶（Chalconesynthase,CHS）的作用下形成黄色的查尔酮，这一步是类黄酮合成途径的第一个限速步骤。然后由查尔酮异构酶（Chalconeisomerase,CHI）催化查尔酮生成无色的柚皮素，柚皮素经黄酮醇-3-羟化酶（Flavanone3-hydroxylase,F3H）催化，生成二氢山奈酚类（DHK），DHK随后分别形成二氢槲皮素（DHQ）和二氢杨梅素（DHM）。上述三个二氢黄酮醇类化合物可在黄酮醇合成酶（Flavonolsynthase，FLS）作用下进入黄酮醇合成途径，产生山奈酚、槲皮素和杨梅素；也可由二氢黄酮醇还原酶（DFR）催化进入花青素合成途径，最终产生花翠素(Delphindin)、矢车菊素(Cyanidin)和花葵素(Pelargonidin)。由于FLS和DFR催化反应的底物相同，因此存在竞争关系。FLS属于2-酮戊二酸依赖性双加氧酶2-oxoglutarate-dependentdioxygenase,2-ODD)家族成员，目前已在矮牵牛、马铃薯、拟南芥、洋桔梗、大豆等植物中克隆其编码基因。在葡萄和拟南芥基因组中发现FLS基因家族分别有5和6个同源基因，功能存在分化。如拟南芥FLS1（AtFLS1）不仅能够催化二氢黄酮醇转化成黄酮醇，还能与F3H共同作用催化柚皮素氧化生成二氢山奈酚。研究表明矮牵牛中利用反义RNA技术抑制FLS基因表达能够导致花青素合成增强并产生粉红色花朵。紫花洋桔梗中抑制FLS基因表达导致花色变红，并且大量积累二氢黄酮醇，黄酮醇含量低于检测限。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种烟草FLS基因在调控植物类黄酮代谢中的应用本专利技术的目的是这样实现的，核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的NtFLS1合成酶基因和NtFLS2合成酶基因在调控植物类黄酮代谢中的应用。本专利技术前期研究烟草FLS基因功能时，在转化FLS基因过表达载体的烟草植株中发现一个FLS基因表达水平受到显著抑制的株系。本专利技术表明抑制FLS基因表达对类黄酮途径其它结构基因如NtCHS、NtCHI，NtF3H，NtANS的表达水平无影响。抑制FLS基因表达使烟草二氢槲皮素含量提高12倍。抑制FLS基因表达未导致槲皮素、山奈酚、二氢山奈酚含量发生变化。抑制FLS基因表达可显著促进代谢流向花青素合成途径，使烟草花中花青素含量提高2.4倍。附图说明图1为本专利技术NtFLS1和NtFLS2基因表达模式分析示意图；图2为类黄酮途径结构基因表达水平分析示意图；图3为转基因烟草中类黄酮物质含量示意图；图4为转基因烟草花器官表型及花青素含量分析示意图。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步的说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术教导所作的任何变换或替换，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术所述的烟草FLS基因在调控植物类黄酮代谢中的应用为核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的NtFLS1合成酶基因和NtFLS2合成酶基因在调控植物类黄酮代谢中的应用。所述的烟草FLS基因在调控植物类黄酮代谢中的应用，其特征在于所述的植物是烟草。NtFLS1合成酶基因编码的氨基酸序列如SEQID：No.3所示；NtFLS2合成酶基因编码的氨基酸序列如SEQID：No.4所示。所述的NtFLS1合成酶基因的克隆方法包括以下步骤：A、提取烟草叶片和花的总RNA，反转录获得cDNA第一链；B、以cDNA第一链作为模板进行PCR扩增反应得到目的基因NtFLS1；C、将目的基因NtFLS1片段连接到pTOPO载体进行测序。B步骤中PCR扩增反应的引物为：NtFLS1_BamHI：GGATCCATGAAAACCCTAACAATGGNtFLS1_XhoI：CTCGAGTCACTGAGGAAGCTTGTTAAG。B步骤中PCR扩增反应的条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环；最后72℃延伸7min。所述的NtFLS2合成酶基因的克隆方法包括以下步骤：A、提取烟草叶片和花的总RNA，反转录获得cDNA第一链；B、以cDNA第一链作为模板进行PCR扩增反应得到目的基因NtFLS2；C、将目的基因NtFLS2片段连接到pTOPO载体进行测序。B步骤中PCR扩增反应的引物为：NtFLS2_BamHI:GGATCCATGAAAACAGCTGAAGCTCA；NtFLS2_XhoI:CTCGAGTCACTGAGGAAGCTTGTTAA。B步骤中PCR扩增反应的条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环；最后72℃延伸7min。本专利技术所述的烟草FLS基因在调控植物类黄酮代谢中的应用为核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的NtFLS1合成酶基因和NtFLS2合成酶基因调控植物类黄酮代谢的方法包括如下步骤：A、构建RNAi载体；B、农杆菌转化：C、RNAi载体导入烟草；D、培养转基因植株。下面以具体实施案例对本专利技术做进一步说明：实施例11、材料与方法1.1植物材料普通烟草（NicotianatabacumYunyan87）叶片、花等组织液氮速冻，-80℃保存用于分析目标基因组织表达特征及基因克隆。转基因烟草叶片液氮速冻用于实时荧光定量检测相关基因表达情况，转基因烟草成熟期叶片用于类黄酮物质含量检测。1.2方法1.2.1NtFLS基因过表达载体构建及烟草遗传转化NtFLS1基因过表达载体构建及烟草遗传转化采用TRIzol（Invitrogen）提取烟草叶片和花的总RNA，反转录获得cDNA第一链（PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser，Takara）作为模板扩增目的基因NtFLS1，引物序列为NtFLS1_BamHI：GGATCCATGAAAACCCTAACAATGG，NtFLS1_XhoI:CTCGAGTCACTGAGGAAGCTTGTTAAG。PCR采用高保真DNA聚合酶（PhusionHigh-FidelityDNAPolymerase，NEB），PCR反应条件为98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环；最后72℃延伸7min。目的基因片段连接到pTOPO（Invitrogen）载体进行测序，用BamHI和XhoI双酶切pTOPO-NtFLS1和pENTRTM2B，分别回收得到目的片段NtFLS1和载体片段pENTRTM2B，利用T4DNALigase连接后得到入门载体pENTRTM2B-NtFLS1，与pK2GW7（目的载体）通过LR反应（Invitrogen）得到植物表达载体pK2-NtFLS1，采用农杆菌介导转化烟草叶盘，筛选获得转基因烟草。NtFLS2基因过表达载体构建及烟草遗传转化采用TRIzol（Invitrogen）提取烟草叶片和花的总RNA，反转录本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种烟草FLS基因在调控植物类黄酮代谢中的应用，其特征在于核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的NtFLS1合成酶基因和NtFLS2合成酶基因在调控植物类黄酮代谢中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种烟草FLS基因在调控植物类黄酮代谢中的应用，其特征在于核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的NtFLS1合成酶基因和NtFLS2合成酶基因在调控植物类黄酮代谢中的应用。2.根据权利要求1所述的烟草FLS基因在调控植物类黄酮代谢中的应用，其特征在于所述的植物是烟草。3.根据权利要求1所述的烟草FLS基因在调控植物类黄酮代谢中的应用，其特征在于NtFLS1合成酶基因编码的氨基酸序列如SEQID：No.3所示；NtFLS2合成酶基因编码的氨基酸序列如SEQID：No.4所示。4.根据权利要求1或3所述的烟草FLS基因在调控植物类黄酮代谢中的应用，其特征在于所述的NtFLS1合成酶基因的克隆方法包括以下步骤：A、提取烟草叶片和花的总RNA，反转录获得cDNA第一链；B、以cDNA第一链作为模板进行PCR扩增反应得到目的基因NtFLS1；C、将目的基因NtFLS1片段连接到pTOPO载体进行测序。5.根据权利要求4所述的烟草FLS基因在调控植物类黄酮代谢中的应用，其特征在于B步骤中PCR扩增反应的引物为：NtFLS1_BamHI：GGATCCATGAAAACCCTAACAATGGNtFLS1_XhoI：CTCGAGTCACTGAGGAAGCTTGTTAAG。6.根据权利要求4所述的烟草FLS基因在调控植物类黄酮代谢中的应用，其特征在于B步骤中PCR扩增反应的条件为：98℃预变性30...
【专利技术属性】
技术研发人员：高玉龙，宋中邦，李文正，王丙武，师君丽，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：云南;53
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