梨PuADH1基因、分离克隆及表达分析的方法、亚细胞定位方法及其应用技术

一种梨PuADH1基因、分离克隆及表达分析的方法、亚细胞定位方法及其在提高果实香气中的应用，梨PuADH1基因，来自于梨树品种‘南果梨’，名称为PuADH1，是如下基因：基因全长1683 bp，BLAST的结果分析证明从‘南果梨’中新得到的基因为一个ADH基因家族成员，从香气浓郁的‘南果梨’果实中获得了与香气合成相关的基因，证明其可能参与番茄果实香气合成，从而扩展了果实香气合成的分子调控途径，另外，克隆香气浓郁的梨品种中有关香气合成的基因可能在很大程度上提高果实香气品质，对农业生产也具有非常重要的理论和实践意义。

【技术实现步骤摘要】
一、
本专利技术涉及一种梨PuADH1基因及其在提高果实香气中的应用，尤其是一种涉及从‘南果梨’中分离、克隆得到一个果实香气相关的乙醇脱氢酶（ADH）家族成员PuADH1基因及其应用。二、
技术介绍
香气是重要的果实品质指标之一。果实浓郁的香气能引导人们的消费趋向，随着人们生活水平的提高和对果品需求层次的提升，果实香气品质研究也越来越受到重视（Muna et al., 2013）。梨是一种重要的世界性水果，世界梨栽培品种可分为东方梨（主要包括砂梨、白梨、秋子梨）和西洋梨两大类。中国是东方梨的生产中心，在世界梨产业中占有十分重要的地位，而我国主栽的白梨、砂梨系统品种绝大多数香味较淡，在很大程度上影响了其品质的全面提升，香气淡已成为阻碍我国鲜梨进入国际市场的重要原因。‘南果梨’果实香气十分浓郁，为梨果实香气育种和研究提供了宝贵试材。研究人员已从梨果实中检测到醛类、醇类、酯类、萜类、烃类及含硫化合物等300余种挥发性物质（Rapparini F et al., 2010）。目前，人们对果实挥发性香气物质的合成路径已经基本明确，即营养物质（如脂肪酸、氨基酸、糖）在生物酶催化下衍生而成（Muna et al., 2013）。根据参与生物合成反应的前体物质不同，合成途径可分为脂肪酸途径、氨基酸途径和萜类途径等（陈发兴等，2010）。脂肪酸途径是包括梨在内的大多数植物香气物质形成的主要来源（Rodríguez et al., 2013；Qin et al., 2014）。脂肪酸途径包括α-氧化、β-氧化、γ-氧化和脂氧合酶（LOX）途径，可合成大多数的酯类、短链醛和醇类化合物。果实香气物质合成的关键酶包括：醇酰基转移酶（AAT）、脂氧合酶（LOX）、乙醇脱氢酶（ADH）、丙酮酸脱羧酶（PDC）等。乙醇脱氢酶（ADH）是果实醇类挥发性化合物形成的关键酶，催化相应醇和醛之间的可逆转化。1982年研究人员（Gerlach et al., 1982）首次从玉米幼根中克隆到一个ADH基因，命名为ADH1基因，目前ADH基因己经从多种果树中克隆得到。王绍华（2010）从成熟香蕉果实中克隆到2个ADH基因MaADH1和MaADH2，MaADH2含有典型的ADH基因结构域，可能在香蕉生长发育中起作用。ADH基因的表达受多种因素调控，ADH基因以动态调控的方式参与果实香气合成，如番茄ADH2基因的过表达通过增加醇（尤其是3Z-己烯醇）的含量，提高果实香气（Speirs et al., 1998）。Tesnière等（2000）从生长发育期葡萄果实中克隆到3个ADH基因VvADH1、VvADH2、VvADH3，Northern杂交表明VvADH2基因在葡萄浆果转熟期时表达量开始显著上升，且ADH活性随之上升，1-MCP处理表明VvADH2的表达和ADH的活性可能受乙烯调控。对于果实香气合成代谢机理的研究，将有助于提高其香气品质，更关系到梨果实综合品质的提高，提升我国梨产业竞争力，具有重要的科学意义和应用价值。。基于现有的技术问题、技术特征和技术效果，做出本专利技术的申请技术方案。三、
技术实现思路
本专利技术的客体是一种梨PuADH1基因：本专利技术的客体是一种梨PuADH1基因的在提高果实香气中的应用：本专利技术的客体是一种梨PuADH1基因分离克隆及表达分析的方法：本专利技术的客体是一种梨PuADH1基因亚细胞定位方法。为了克服上述技术缺点，本专利技术的目的是提供一种梨PuADH1基因及其在提高果实香气中的应用，因此从香气浓郁的‘南果梨’果实中获得了与香气合成相关的基因，证明其可能参与番茄果实香气合成，从而扩展了果实香气合成的分子调控途径，另外，克隆梨中有关香气合成的基因很大程度上提高果实香气品质，对农业生产也具有非常重要的理论和实践意义。为达到上述目的，本专利技术采取的技术方案是：梨PuADH1基因，来自于果树梨‘南果梨’，名称为PuADH1，是如下基因：基因全长1683 bp，BLAST的结果分析证明从‘南果梨’中新得到的基因为一个ADH基因家族成员。本专利技术的优选技术方案，属于ADH家族成员， cDNA开放阅读框（ORF）1683bp，编码561个氨基酸；经Blast分析，Aldehyde dehydrogenase family 3 member I1蛋白属于ALDH-SFsuperfamily 家族，其与苹果ADH氨基酸同源性较高；编码氨基酸理论分子量为137.826kDa，理论等电点为4.99，原子组成为C5088H8495N1683O2129S328，总原子数为17723；该蛋白由4种氨基酸组成，总平均疏水性为0.745，脂质指数为 29.95，说明该蛋白是亲水性蛋白；其不稳定系数为40.74，说明该蛋白是一个不稳定蛋白。本专利技术的优选技术方案，含有所述PuADH1基因的宿主菌。本专利技术的优选技术方案，克隆所述PuADH1基因cDNA序列的引物对，F：5′- CCCCCGGGATGAAAGGCCTCTGCATTGA-3′；R：5′-CGGGATCCTCATTTAGACCATCCAATCAG-3′。本专利技术的优选技术方案，对所述PuADH1基因的进一步研究表明，该基因在促进番茄果实香气合成中的应用。本专利技术的优选技术方案，含有所述PuADH1基因的重组表达载体。本专利技术的优选技术方案，重组表达载体优选以pRI101为出发载体，用T4连接酶将目的基因定向连接到pRI101载体Xma I 和BamH I位点上，构建重组表达载体PRI101-PuADH1。本专利技术的优选技术方案，所述的重组表达载体在促进番茄果实香气中的应用。本专利技术的优选技术方案，一种梨PuADH1基因分离克隆及表达分析的方法，其步骤为：从‘南果梨’果实中抽提RNA，经反转录得到的第一链cDNA用于扩增PuADH1基因全长，RNA抽提使用Trizol试剂盒，抽提1μg总RNA样品经1U Dnase，第一链cDNA的合成用TOYOBO反转录试剂盒，扩增基因引物对为：PuADH1-F: 5’-ATGTCTAATACTGCTGGTCAGG -3’；PuADH1-R: 5’ -CATAATCCACATGGAGGAATGA -3’；用RT-PCR方法扩增‘南果梨’PuADH1基因编码的序列全长，25 µl反应体系包括：200 ng cDNA，1×缓冲液即ransStart FastPfu Buffer，l0 mM dNTP，l U Taq 聚合酶即TransStart FastPfu DNA Polymerase，1.0 µM上述引物，反应程序：94 ℃，3 min；94 ℃变性30 s；50 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min；35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃，10 min。产生一条特异条带产物，经1 %的琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶回收试剂盒回收纯化的DNA溶液与pMD-19T载体进行连接、转化及鉴定，具体方法参照按照分子克隆实验手册进行。本专利技术的优选技术方案，一种梨PuADH1基因亚细胞定位方法，其步骤：用大肠杆菌菌株为E.coli March（Invitrogen），农杆菌菌株为GV3101，用于转化拟南芥，入门载体为pENTR/D/TOPO vector（Invitrogen），本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种梨PuADH1基因，其特征是：梨PuADH1基因，来自于梨树品种‘南果梨’，名称为PuADH1，是如下基因：基因全长1683 bp，BLAST的结果分析证明从‘南果梨’中新得到的基因为一个ADH基因家族成员。

【技术特征摘要】
1.一种梨PuADH1基因，其特征是：梨PuADH1基因，来自于梨树品种‘南果梨’，名称为PuADH1，是如下基因：基因全长1683 bp，BLAST的结果分析证明从‘南果梨’中新得到的基因为一个ADH基因家族成员。2.根据权利要求1所述的梨PuADH1基因，其特征是： 属于ADH家族成员， cDNA开放阅读框（ORF）1683bp，编码561个氨基酸；经Blast分析，Aldehyde dehydrogenase family 3 member I1蛋白属于ALDH-SFsuperfamily 家族，其与苹果ADH氨基酸同源性较高；编码氨基酸理论分子量为137.826kDa，理论等电点为4.99，原子组成为C5088H8495N1683O2129S328，总原子数为17723；该蛋白由4种氨基酸组成，总平均疏水性为0.745，脂质指数为 29.95，说明该蛋白是亲水性蛋白；其不稳定系数为40.74，说明该蛋白是一个不稳定蛋白。3.根据权利要求1所述的梨PuADH1基因，其特征是：含有所述PuADH1基因的宿主菌。4.根据权利要求1所述的梨PuADH1基因，其特征是：克隆所述PuADH1基因cDNA序列的引物对，F：5′- CCCCCGGGATGAAAGGCCTCTGCATTGA-3′；R：5′-CGGGATCCTCATTTAGACCATCCAATCAG-3′。5.一种梨PuADH1基因的在提高果实香气中的应用，对所述PuADH1基因的进一步研究表明，该基因在促进番茄果实香气合成中的应用。6.根据权利要求1所述的梨PuADH1基因，其特征是：含有所述PuADH1基因的重组表达载体。7.根据权利要求6所述的梨PuADH1基因，其特征是：重组表达载体优选以pRI101为出发载体，用T4连接酶将目的基因定向连接到pRI101载体Xma I 和BamH I位点上，构建重组表达载体PRI101-PuADH1。8.一种梨PuADH1基因的在提高果实香气中的应用，所述的重组表达载体在促进番茄果实香气中的应用。9.一种梨PuADH1基因分离克隆及表达分析的方法，其特征是：其步骤：从‘南果梨’果实中抽提RNA，经反转录得到的第一链cDNA用于扩增PuADH1基因全长，RNA抽提使用Trizol试剂盒，抽提1μg总RNA样品经1U Dnase，第一链cDNA的合成用TOYOBO反转录试剂盒，扩增基因引物对为：PuADH1-F: 5’-ATGTCTAATACTGCTGGTCAGG -3’；PuADH1-R: 5’ -CATAATCCACATGGAGGAATGA -3’ ；用RT-PCR方法扩增‘南果梨’PuADH1基因编码的序列全长，25 µl反应体系包括：200 ng cDNA，1×缓冲液即ransStart FastPfu Buffer，l0 mM dNTP，l U Taq 聚合酶即TransStart FastPfu DNA Polymerase，1.0 µM上述引物，反应程序：94 ℃，3 min；94 ℃变性30 s；50 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min；35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃，10 min,产生一条特异条带产物，经1 %的琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶回收试剂盒回收纯化的DNA溶液与pMD-19T载体进行连接、转化及鉴定，具体方法参照按照分子克隆实验手册进行。10.一种梨PuADH1基因亚细胞定位方法，其步骤：用大肠杆菌菌株为E.coli March（Invitrogen），农杆菌菌株为GV3101，用于转化拟南芥，入门载体为pENTR/D/TOPO vector（Invitrogen），目标载体为GW-GFP，2.1表达载体转化农杆菌 (1)从-80 ℃取出 GV3101 感受态细胞（200 µL），冰上解冻，立即加1-5 µL 质粒DNA，(2)冰上放置5 min，(3)液氮中冷冻 5 min，(4)37℃水浴5 min，(5)加入无抗生素的 YEP 液体培养基 1 mL，28 ℃摇床培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏树伟，王少敏，
申请(专利权)人：山东省果树研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37