一种从牛血中提取超氧化物歧化酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种从牛血中提取超氧化物歧化酶的方法，包括如下步骤进行：(1)将牛血进行抗凝处理，离心，沉淀物用生理盐水洗涤，制得红细胞，用超声波破壁处理，加入去离子水，冰浴下静置后得到溶血液；(2)向溶血液中加入乙醇，再加入氯仿，然后搅拌、静置、离心后收集上清液获得粗酶液；(3)向粗酶液中加入丙酮，然后搅拌、离心，取沉淀物；(4)将沉淀物用磷酸盐缓冲液溶解，搅拌、离心后获得上清液；(5)通过透析除去盐离子，再冷冻干燥，制得成品超氧化物歧化酶。本发明专利技术的制备方法简化了生产工艺，适合工业化大规模生产。

A method for extracting superoxide dismutase from bovine blood.

The invention discloses a method for extracting superoxide dismutase from bovine blood, which comprises the following steps: (1) the blood anticoagulant treatment, centrifugation, sediment washed with saline, prepared with red blood cells by ultrasonic treatment, adding deionized water, ice bath under static obtained hemolysis; (2) to the solution, adding ethanol in blood, then add chloroform, then mixing, static after centrifugation, the supernatant was collected to obtain crude enzyme liquid; (3) adding acetone to crude enzyme, then stirring, centrifugal, take the sediment; (4) the precipitate with phosphate buffer solution, stirring, after centrifugation the supernatant was removed by dialysis; (5) salt ions, freeze-dried and prepared products of superoxide dismutase. The preparation method of the invention simplifies the production process and is suitable for industrial large-scale production.

【技术实现步骤摘要】
一种从牛血中提取超氧化物歧化酶的方法
本专利技术属于牛血加工领域，具体涉及一种从牛血中提取超氧化物歧化酶的方法。
技术介绍
超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase简称SOD)是一种新型酶制剂，广泛存在于动植物、微生物中的金属酶，SOD被视为生命科技中最具神奇魔力的酶，是机体内O2-的天然消除剂，在生物体的免疫系统中起着极为重要的作用。牛血中营养丰富，蛋白含量高达20％左右，有“液体肉“之称。牛血可以通过离心分离得到血浆和血球，血浆中主要含有白蛋白，血球中含有血红蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶等，其中血红蛋白占血球总蛋白量的90％以上，SOD占0.3％-0.5％。目前，已经有两种方法提取SOD，一种方法使用有机溶剂萃取SOD，该方法处理量比较小，生产成本高，无法大规模生产；另一种方法使用铜盐沉淀血红蛋白纯化SOD，该方法生成的血红蛋白含有大量的铜离子，无法被再利用，浪费了大量珍贵的蛋白资源，而且这些蛋白排放还会造成环境污染。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的问题，提供了一种从牛血中提取超氧化物歧化酶的方法。本专利技术采用的技术方案：从牛血中提取超氧化物歧化酶的方法，包括如下步骤：(1)将牛血进行抗凝处理，离心，沉淀物用生理盐水洗涤，制得红细胞，用超声波破壁处理，加入去离子水，冰浴下静置后得到溶血液；(2)向溶血液中加入0-4℃的乙醇溶液，再加入0-4℃的氯仿，然后搅拌、静置、离心后收集上清液获得粗酶液；(3)向粗酶液中加入丙酮，然后搅拌、离心，取沉淀物；(4)将沉淀物用磷酸盐缓冲液溶解，搅拌、离心后获得上清液；(5)通过透析除去盐离子，再冷冻干燥，制得成品超氧化物歧化酶。优选，超声波破壁处理的具体过程为超声功率为100-200W，超声5-20min。优选，抗凝剂采用柠檬酸三钠，其浓度为0.5-2％，其体积是牛血体积的10-20％。优选，磷酸盐缓冲液为K2HPO4-KH2PO4的混合溶液。优选，上述步骤(4)获得上清液可采用柱层析法进一步提纯。本专利技术与现有技术相比达到的有益效果:本专利技术采用超声破壁处理，采用高效分离、提取，生产方法简单、周期短、污染小，适用于SOD的工业化生产。经检测，采用本方法提取的牛血SOD，其单位酶活可以达到4000U/mg以上。具体实施方式实施例1向牛血中加入20％体积的0.5％柠檬酸三钠，4000rpm离心10min去血浆，收集红细胞。然后加入5倍的0.9％NaCl溶液进行清洗，期间不断搅拌后，4000rpm离心20min，弃去上清液后，收集红细胞，用功率为200W的超声波破壁处理10min，并加入2倍体积比的去离子水，4℃水浴下静置12h后得到溶血液；向溶血液中缓慢加入4℃下冷预过的0.25体积的95％乙醇后，再缓慢加入预冷过的0.2体积的氯仿，搅拌30min；静置1h后，4000rmp离心10min，收集上清液获得粗酶；向粗酶液中加入3倍体积的丙酮，搅拌20min后，4000rmp离心10min，取沉淀物；将沉淀物用加入2倍体积的去离子水进行溶解，并在60℃温度下热处理15min后，迅速冰浴至4℃以下。然后，加入15倍体积的K2HPO4-KH2PO4的混合缓冲溶液，搅拌5min后，4000rmp离心10min，获得上清液。通过透析工艺除去盐离子，并最终将精致酶液进行冷冻干燥，可以获得SOD成品。实施例2向牛血中加入10％体积的2％柠檬酸三钠，5000rpm离心5min去血浆，收集红细胞。然后加入5倍的0.9％NaCl溶液进行清洗，期间不断搅拌后，5000rpm离心5min，弃去上清液后，收集红细胞，用功率为100W的超声波破壁处理20min，并加入2倍体积比的去离子水，4℃水浴下静置10h后得到溶血液；向溶血液中缓慢加入4℃下冷预过的0.5体积的95％乙醇后，再缓慢加入预冷过的0.3体积的氯仿，搅拌20min；静置2h后，5000rmp离心5min，收集上清液获得粗酶；向粗酶液中加入3倍体积的丙酮，搅拌10min后，5000rmp离心5min，取沉淀物；将沉淀物用加入3倍体积的去离子水进行溶解，并在60℃温度下热处理15min后，迅速冰浴至4℃以下。然后，加入20倍体积的K2HPO4-KH2PO4的混合缓冲溶液，搅拌5min后，4000rmp离心20min，获得上清液。上清液可通过柱层析法进一步提纯，提纯后通过透析工艺除去盐离子，并最终将精致酶液进行冷冻干燥，可以获得SOD成品。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从牛血中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于：包括如下步骤进行：(1)将牛血进行抗凝处理，离心，沉淀物用生理盐水洗涤，制得红细胞，用超声波破壁处理，加入去离子水，冰浴下静置后得到溶血液；(2)向溶血液中加入0‑4℃的乙醇溶液，再加入0‑4℃的氯仿，然后搅拌、静置、离心后收集上清液获得粗酶液；(3)向粗酶液中加入丙酮，然后搅拌、离心，取沉淀物；(4)将沉淀物用磷酸盐缓冲液溶解，搅拌、离心后获得上清液；(5)通过透析除去盐离子，再冷冻干燥，制得成品超氧化物歧化酶。

【技术特征摘要】
1.一种从牛血中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于：包括如下步骤进行：(1)将牛血进行抗凝处理，离心，沉淀物用生理盐水洗涤，制得红细胞，用超声波破壁处理，加入去离子水，冰浴下静置后得到溶血液；(2)向溶血液中加入0-4℃的乙醇溶液，再加入0-4℃的氯仿，然后搅拌、静置、离心后收集上清液获得粗酶液；(3)向粗酶液中加入丙酮，然后搅拌、离心，取沉淀物；(4)将沉淀物用磷酸盐缓冲液溶解，搅拌、离心后获得上清液；(5)通过透析除去盐离子，再冷冻干燥，制得成品超氧化物歧化酶。2.根据权利要求1所述的一种从牛血中提...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭春萍，韦云伊，刘容，黄广君，黄福标，张艳雯，于冬玲，
申请(专利权)人：南宁学院，
类型：发明
国别省市：广西,45