一种具有生物活性的COX52‑69多肽的固相合成方法及其用途技术

本发明专利技术提供了一种具有生物活性的COX52‑69多肽的固相合成方法，该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述固相合成方法包括以下步骤：按照多肽的顺序重复添加肽链上的下一氨基酸，直至整条肽链18个氨基酸全部添加完成并检测通过；加入切割液，在通风橱中室温搅拌裂解，制得多肽粗品；利用高效液相色谱检测合成的多肽粗品，并分析合成产物中多肽的纯度；用质谱检测多肽粗品的分子量，确定合成的多肽是否是目标产物。本发明专利技术利用化学合成的多肽在动物体内体外实验，均发现化学合成的多肽有抑制葡萄糖引起的胰岛素分泌的功能和减轻体重的作用，能够用于制备抵抗高胰岛素血症和减轻体重的药物中，其具有生物活性。

A biologically active COX

The present invention provides a biologically active COX

【技术实现步骤摘要】
一种具有生物活性的COX52-69多肽的固相合成方法及其用途
本专利技术提供了一种采用化学合成的方法-Fmoc法合成COX52-69多肽的工艺，采用该方法所合成的COX52-69多肽在动物体内体外实验，证明其具有生物活性；并且本专利技术中还提供了所述COX52-69多肽的用途，属于生物医药

技术介绍
短肽COX52-69是一条含有18个氨基酸的多肽，最初是从猪的小肠中分离纯化出来的，经氨基酸序列比对后发现其与细胞色素氧化酶Ⅷ的第52至69完全重叠，所以命名COX52-69。其序列为LLPAGWVLSHLDSYKKRE。用生化分离纯化得到的COX52-69多肽做功能实验发现该多肽能够抑制葡萄糖引起的胰岛素的分泌，该发现目前已于2013年10月11日申请中国专利技术专利，申请号为201310471571.9。在该专利申请中通过从生物组织(猪肠道)中分离纯化获得COX52-69多肽，但是从生物组织中分离纯化获得COX52-69多肽是一个高成本的过程。为此需要寻求一种非生化分离的方法以获取有活性的该肽，并能够提高了产量和降低了成本。然而在本领域中，虽然通过化学合成或生物工程的方法获得一个多肽是件容易的事，但是这些获得的多肽通常是没有生物活性的。
技术实现思路
本专利技术解决了现有技术中的不足，提供了一种具有生物活性的COX52-69多肽的固相合成方法，并且利用化学合成的COX52-69多肽在动物体内体外实验，均发现化学合成的COX52-69多肽有抑制葡萄糖引起的胰岛素分泌的功能和减轻体重的作用，即具有生物活性。实现本专利技术上述目的所采用的技术方案为：一种具有生物活性的COX52-69多肽的固相合成方法，该多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示：LLPAGWVLSHLDSYKKRE，所述固相合成方法包括以下步骤：(1)、缩合反应：使用DMF预溶胀树脂，滤去溶剂备用；向反应柱中加入脱保护试剂，反应后脱去树脂上的的FMoc保护基团，抽干，继续采用DMF清洗后抽干，并检测；称取第一个Fmoc-氨基酸Fmoc-GLu(tBu)-OH，同时称取HOBt备用，将二者同时加入反应柱中，并且溶于DCM中，然后加入DIC并搅拌；称取DMAP投入反应柱中；氨基酸与反应试剂一同反应，反应完毕后抽干并用DMF清洗；向反应柱中加入脱保护试剂，反应后，脱去树脂上的的FMoc保护基团，抽干，继续采用DMF清洗后抽干，并检测；接下来的按照COX52-69多肽的顺序重复添加肽链上的下一氨基酸，直至整条肽链18个氨基酸全部添加完成并检测通过；全部完成后，使用无水甲醇清洗并使用抽滤瓶将其抽干；(2)、肽链的切割：在抽干的合成肽树脂中加入切割液，在通风橱中室温搅拌裂解，使用砂芯漏斗过滤除去树脂，收集滤液，滤液经乙醚萃取后放置于干燥瓶内进行干燥，直至其成为白色粉末，即制得多肽粗品；(3)、粗肽的检测和纯化：利用高效液相色谱检测合成的多肽粗品，并分析合成产物中多肽的纯度；(4)、肽的质谱鉴定：用质谱检测多肽粗品的分子量，确定合成的多肽是否是目标产物，最后将收集的样品用三氟乙酸和水溶解制成溶液倒入样品杯中，冷冻过夜，次日用真空干燥剂冷冻干燥，最后获得的白色粉末状物质即为纯品COX52-69多肽。步骤(1)中所述脱保护及缩合反应的检测方法如下：检测时分别取三滴5％茚三酮无水乙醇溶液和三滴80％苯酚无水乙醇溶液与待检测树脂颗粒充分混匀，105℃加热5min，观察颜色变化，若变蓝色或紫色，则说明游离氨基存在，脱保护完全；若为亮黄色或无色则表示缩合完全，能够继续进行下一个缩合反应。步骤(1)中在合成每一个氨基酸时，反应过程中维持温度在25℃～28℃。步骤(2)中萃取的步骤为：在滤液中按1：10的体积比加入事先4℃下预冷的乙醚，进行萃取，再以每分钟3000转的速度离心2分钟，并使用乙醚清洗离心管，清洗3次，每次清洗都配合有2分钟离心。步骤(3)中高效液相色谱检测的方法为：取多肽粗品置于EP管，加入三氟乙酸和水，于超声振荡机中震荡使多肽粗品溶解，用C18分析柱进行HPLC，流动相：A相：乙腈，0.1％TFA；B相：水，0.1％TFA，洗脱梯度：B相的浓度从90％到0，洗脱速度1mL/min，洗脱时间25min，检测波长220nm。步骤(4)中质谱分析采用ESI正离子模式，离子电压为8000v，碰撞气体为N2，脱溶剂气温度350e，注射泵进样速度为10uL/min。本专利技术同时还提供了上述利用化学合成的方法-Fmoc法所合成COX52-69多肽得新的用途，用于制备抵抗高胰岛素血症和减轻体重的药物中。本专利技术中公开了可以用非生化分离的方法获得正确的有生物活性的COX52-69多肽，简化了获得该多肽的生化繁琐程序，而且还能够根据目的需要对序列中的氨基酸或化学键进行目的性的修饰。经过以上合成制备及修饰或优化后，该多肽开发成药物的成本就大大降低，效果也会更高。为后续药物开发提供了简洁可行的方法。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1、本领域中通过化学合成或生物工程的方法获得的多肽通常是没有生物活性的，然而采用本申请所提供的固相合成方法，能够制备出具有生物活性的COX52-69多肽。2、本专利技术中通过人工合成具有生物活性的COX52-69多肽，大大的简化了其制备步骤，降低了生产成本，能够实现工业化大规模制备。3、本专利技术中还提供了该多肽的新的用途，即能够用于制备抵抗高胰岛素血症和减轻体重的药物中。4、由于本申请中为采用人工合成的方法所制备的，因此能够极方便的根据目的需要对序列中的氨基酸或化学键进行目的性的修饰，以做进一步的研究开发。附图说明图1为本实施例中所制备的COX52-69多肽的HPLC色谱图；图2为本实施例中所制备的COX52-69多肽的质谱分析图；图3为本专利技术实施例中动物大鼠腹腔注射COX52-69后引起胰岛素浓度的变化图；图4为实施例中实验组和对照组的体重变化对比图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做详细具体的说明，但是本专利技术的保护范围并不局限于以下实施例。本实施例中所提供的具有生物活性的COX52-69多肽的固相合成方法中所采用的试剂如下：1.实用王树脂(WangResin，0.47mmol/g)购自天津南开和成科技有限公司；2.Fmoc-Tyr(tBu)-OH等其他使用Fmoc保护的氨基酸均购自上海吉尔生化；3.缩合试剂N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)购自上海吉尔生化(分析纯)；4.1-羟基-苯丙-三氮唑(HOBt)购自上海吉尔生化(分析纯)；5.二异丙基乙胺(DIEA)购自上海吉尔生化(分析纯)；6.二甲氨基吡啶(DMAP)购自苏州昊帆生物科技公司(分析纯)；7.二异丙基碳二亚胺(DIC)购自上海吉尔生化(分析纯)；9.二环己基碳二亚胺(DCC)购自上海吉尔生化(分析纯)；10.2，6-二氯苯甲酰氯(DCB)购自上海吉尔生化(分析纯)；11.二甲基甲酰胺(DMF)购自上海吉尔生化(分析纯)；12.二氯甲烷(DCM)购自上海吉尔生化(分析纯)；13.哌啶(PIP)购自上海吉尔生化(分析纯)；14.甲醇(MeOH)购自上海吉尔生化(分析纯)；15.四氢呋喃(THF)购自上海吉尔生化(分析纯)；16.吡啶(Py)购自上海吉尔生化(分析纯)；17.三氟乙酸(TFA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有生物活性的COX

【技术特征摘要】
1.一种具有生物活性的COX52-69多肽的固相合成方法，该多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示：LLPAGWVLSHLDSYKKRE，其特征在于所述固相合成方法包括以下步骤：(1)、缩合反应：使用DMF预溶胀树脂，滤去溶剂备用；向反应柱中加入脱保护试剂，反应后脱去树脂上的的FMoc保护基团，抽干，继续采用DMF清洗后抽干，并检测；称取第一个Fmoc-氨基酸Fmoc-GLu(tBu)-OH，同时称取HOBt备用，将二者同时加入反应柱中，并且溶于DCM中，然后加入DIC并搅拌；称取DMAP投入反应柱中；氨基酸与反应试剂一同反应，反应完毕后抽干并用DMF清洗；向反应柱中加入脱保护试剂，反应后，脱去树脂上的的FMoc保护基团，抽干，继续采用DMF清洗后抽干，并检测；接下来的按照COX52-69多肽的顺序重复添加肽链上的下一氨基酸，直至整条肽链18个氨基酸全部添加完成并检测通过；全部完成后，使用无水甲醇清洗并使用抽滤瓶将其抽干；(2)、肽链的切割：在抽干的合成肽树脂中加入切割液，在通风橱中室温搅拌裂解，使用砂芯漏斗过滤除去树脂，收集滤液，滤液经乙醚萃取后放置于干燥瓶内进行干燥，直至其成为白色粉末，即制得多肽粗品；(3)、粗肽的检测和纯化：利用高效液相色谱检测合成的多肽粗品，并分析合成产物中多肽的纯度；(4)、肽的质谱鉴定：用质谱检测多肽粗品的分子量，确定合成的多肽是否是目标产物，最后将收集的样品用三氟乙酸和水溶解制成溶液倒入样品杯中，冷冻过夜，次日用真空干燥剂冷冻干燥，最后获得的白色粉末状物质即为纯品COX52-69...

【专利技术属性】
技术研发人员：李臣鸿，白天宇，王梅杰，
申请(专利权)人：中南民族大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42