一种可调节的荧光素酶分段融合蛋白、其制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种可调节的荧光素酶分段融合蛋白、其制备方法及应用，所述融合蛋白包括荧光素酶N端蛋白、柔性肽段1、MBP蛋白、活性阀门、柔性肽段2和荧光素酶C端蛋白；其中，所述荧光素酶N端蛋白和荧光素酶C端蛋白共同组成荧光素酶；所述活性阀门为一段4-8个疏水短肽氨基酸。通过短肽链氨基酸序列作为“活性阀门”并以特异性剪切酶作为“阀门钥匙”的活性调节方式，实现一种新型的荧光互补蛋白开关模式，可用于评估其他蛋白质动态相互作用如配体与底物的结合作用、能产生新结合位点的相互作用、使蛋白去活化的蛋白-蛋白相互作用、改变蛋白作用底物特异性的蛋白-蛋白相互作用。

Adjustable luciferase segment fusion protein, preparation method and application thereof

The present invention relates to the technical field of molecular biology, in particular to an adjustable sectional luciferase fusion protein, preparation method and application thereof, wherein the fusion protein including N luciferase end protein, flexible peptide 1, MBP protein, active valve, flexible peptide 2 and luciferase C terminal protein; wherein, the luciferase N terminal protein and luciferase C terminal protein composed of luciferase; the activity of the valve as a hydrophobic amino acid peptide 4-8. The short chain amino acid sequence as \active valve\ and the specific enzyme as a \shear valve key\ active regulation mode, the realization of a new fluorescent protein complementary switch mode, can be used to evaluate the dynamic interaction of other proteins such as ligand and substrate binding, can produce new binding sites, the protein interaction go to the activation of protein interactions, changes in protein substrate specificity of protein protein interaction.

【技术实现步骤摘要】
一种可调节的荧光素酶分段融合蛋白、其制备方法及应用
本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及一种可调节的荧光素酶分段融合蛋白、其制备方法及应用。
技术介绍
随着对亚细胞结构和功能、分子生理和病理、细胞间和细胞内信号通路研究的深入，人类对疾病和对生命本质的认识不断追朔到蛋白质、基因水平。而许多生命活动是以蛋白质分子的结合和解离来实现的，细胞的各种重要生理活动，细胞对外界环境及内环境作用的反应等，均是以蛋白质间相互作用为纽带，通过调控、介导细胞的生物学活性，形成信号转导网络系统。因此，对蛋白质相互作用的深入研究是认识和理解各种生命现象的必要前提。荧光素酶在有氧的条件下通过催化底物氧化而产生荧光，发射波长范围为400-600nm，峰值在450-500nm，且因其灵敏性高，特异性好，反应迅速，无生物性毒害等优势，可实时靶向基因分子事件、细胞生命活动、动物生理病理等生物学过程，是研究生物体内蛋白质动态相互作用的重要基础，目前被广泛应用于生命科学、医学研究及药物研发等相关领域。传统研究蛋白质相互作用的方法有酵母双杂交、磷酸化抗体、免疫荧光、放射性标记等，但这些方法存在假阳性高，不能获得定量化信息，在实际的生理环境中需要破碎细胞造成机械损伤，无法做到在活细胞生理条件下实时监测细胞内蛋白质相互作用等缺陷。现今最为常见的活细胞蛋白质相互作用模型有2种，一种是CFP和YFP等荧光蛋白质来实现的荧光共振能量转移(FRET)。这种技术由于荧光蛋白的量子产率低，供体与受体荧光光谱的差异小等问题，在实际开展中导致检测通道间相互干扰，高背景噪音等现象，要求非常苛刻的校准过程去除干扰降噪，这些都极大地限制了该技术进一步的发展和广泛的应用。另外一种是双分子荧光互补技术用于细胞体内蛋白质相互作用动态研究。CN101620233A公开了一种利用双分子荧光互补技术，基于橙红荧光蛋白和远红荧光蛋白，进行检测蛋白质之间的相互作用。但双荧光互补技术(BiFC)实时性较差，其要求两个片段在切开面能互补重新整合形成完整的荧光蛋白恢复荧光蛋白活性，此过程因组装分子荧光互补体系的不同而存在时间上的差异，几分钟甚至到几小时才能顺利检测到荧光互补信号，特别在活细胞体内这样一个复杂的环境，实际情况不得而知，仅仅通过光学信号强度改变来评估蛋白质相互作用在极大程度上可能存在偏差。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种可调节的荧光素酶分段融合蛋白，所述融合蛋白包括荧光素酶N端蛋白、柔性肽段1、MBP蛋白、活性阀门、柔性肽段2和荧光素酶C端蛋白；其中，所述荧光素酶N端蛋白和荧光素酶C端蛋白共同组成荧光素酶；所述活性阀门为一段4-8个疏水短肽氨基酸。本专利技术制备得到的可调节的荧光素酶分段融合蛋白，其基于荧光素酶的高荧光强度，设计在荧光素酶基因的位点之间引入一段4～8个短肽链氨基酸序列作为“活性阀门”，并在该氨基酸序列的两侧引入一段疏水性并具有一定伸展性的柔性肽链以减小“阀门钥匙”作用时造成的空间位阻，同时设计引入malE基因表达MBP蛋白促进荧光素酶融合体的可溶性表达。这样可将荧光素酶基因分开形成2个片段，分别为N端和C端的2个多肽链，当荧光素酶基因的N片段、C片段、“活性阀门”和malE的融合片段在细胞内共同表达时，融合体蛋白中的2个荧光素酶片段在空间距离上很靠近而产生相互作用可实现荧光互补，会形成完整的具有生物活性的荧光素酶，它能催化相应的底物而产生荧光信号，实现动态相互作用模型的ON模式。当向该体系加入“活性阀门”氨基酸序列的“阀门钥匙”即特异性剪切酶时，因其特异性剪切作用，会将荧光素酶的2个片段在空间上切开，加入相应的底物时，会形成2个不产生荧光信号的N片段和C片段，实现动态相互作用模型的OFF模式。作为优选技术方案，所述活性阀门位于荧光素酶中间靠近N端位置。本专利技术中，活性阀门可以插入荧光素酶的任何位置，优选为中间靠近N端的位置，如Gaussia荧光素酶的Arg93和Cys94，Renilla荧光素酶的Leu110和Pro111位点及Gly229和Lys230都是可行的。优选地，所述活性阀门的氨基酸序列包括IEGR，ENLYPQG，PLGMWSR，PLGVR，LVPRGS，DDDDK，LEVLFQGP或LEVLFQGP中的任意一种。优选地，所述荧光素酶包括Gaussia荧光素酶、Renilla荧光素酶、Cypridina荧光素酶或RedFirefly荧光素酶中的任意一种。优选地，所述柔性肽段1和柔性肽段2分别独立选自GGGS，(GGGS)2，(GGGS)3，(GGGS)4，GSGS，(GSGS)2，(GSGS)3，(GSGS)4中的任意一种。本专利技术中，所述柔性肽段可减少特异性酶切造成的空间位阻。第二方面，本专利技术提供一种DNA片段，所述DNA片段编码如第一方面所述的融合蛋白。第三方面，本专利技术提供一种表达载体，所述表达载体含有至少一个拷贝的如第二方面所述的DNA片段。第四方面，本专利技术提供一种重组的宿主细胞，所述宿主细胞含有第三方面所述的表达载体。第五方面，本专利技术提供一种如第一方面所述的可调节的荧光素酶分段融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：(1)选取插入位点，采用分段克隆，逐段构建包含荧光素酶N端蛋白、柔性肽段1、MBP蛋白、活性阀门、柔性肽段2和荧光素酶C端蛋白的重组载体；(2)将重组载体转化到克隆菌种，筛选含有所述融合蛋白基因序列的阳性转化菌；(3)从所述阳性转化菌中提取所述重组载体，并转化到表达菌中，得到含有所述融合蛋白的基因序列的阳性表达菌，对所述阳性表达菌扩大培养，诱导所述融合蛋白表达；(4)融合蛋白的表达及纯化。第六方面，本专利技术提供一种如第一方面所述的可调节的荧光素酶分段融合蛋白用于蛋白动态相互作用的模型的构建和检测。优选地，所述检测可用于核酸、蛋白、细菌、病毒或重金属离子的检测。本专利技术中的蛋白质动态相互作用模型，不仅可直接对体系中能够影响荧光素酶片段的生物标记物进行定量检测，也可通过在两个片段的柔性肽链末端修饰生物标志物，如DNA、RNA、核酸类似物、蛋白、抗体、多肽等，利用生物分子诱导荧光素酶片段重建互补ON模式，从而实现对多种生物标记物的靶向物质检测。优选地，所述模型的构建方法包括以下步骤：(1’)将制备得到的荧光素酶分段融合蛋白与底物进行混合，用酶标仪检测体系中的生物发光强度；(2’)向步骤(1)的体系中加入剪切酶，孵育，再加入底物，混匀后通过酶标仪检测体系中的生物发光强度。优选地，所述底物的浓度为0.1-1μg/μL，例如可以是0.1μg/μL、0.2μg/μL、0.3μg/μL、0.4μg/μL、0.5μg/μL、0.6μg/μL、0.7μg/μL、0.8μg/μL、0.9μg/μL或1μg/μL，优选为0.2-0.8μg/μL，进一步优选为0.5μg/μL。优选地，所述底物为肠腔素、荧光素或海萤荧光素中的任意一种或至少两种的混合。优选地，所述剪切酶为FactorXa因子蛋白酶，烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶，基质金属蛋白酶-9，基质金属蛋白酶-2，凝血酶，肠激酶，PreScission蛋白酶或人鼻病毒3C蛋白酶中的任意一种。本专利技术中，剪切酶作为“活性阀门”的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可调节的荧光素酶分段融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括荧光素酶N端蛋白、柔性肽段1、MBP蛋白、活性阀门、柔性肽段2和荧光素酶C端蛋白；其中，所述荧光素酶N端蛋白和荧光素酶C端蛋白共同组成荧光素酶；所述活性阀门为一段4‑8个疏水短肽氨基酸。

【技术特征摘要】
1.一种可调节的荧光素酶分段融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括荧光素酶N端蛋白、柔性肽段1、MBP蛋白、活性阀门、柔性肽段2和荧光素酶C端蛋白；其中，所述荧光素酶N端蛋白和荧光素酶C端蛋白共同组成荧光素酶；所述活性阀门为一段4-8个疏水短肽氨基酸。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述活性阀门位于荧光素酶中间靠近N端位置；优选地，所述活性阀门的氨基酸序列包括IEGR，ENLYPQG，PLGMWSR，PLGVR，LVPRGS，DDDDK，LEVLFQGP或LEVLFQGP中的任意一种。3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述荧光素酶包括Gaussia荧光素酶、Renilla荧光素酶、Cypridina荧光素酶或RedFirefly荧光素酶中的任意一种；优选地，所述柔性肽段1和柔性肽段2分别独立选自GGGS，(GGGS)2，(GGGS)3，(GGGS)4，GSGS，(GSGS)2，(GSGS)3，(GSGS)4中的任意一种。4.一种DNA片段，其特征在于，所述DNA片段编码如权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白。5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个拷贝的如权利要求4所述的DNA片段。6.一种重组的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求5所述的表达载体。7.一种如权利要求1-3中任一项所述的可调节的荧光素酶分段融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)选取...

【专利技术属性】
技术研发人员：金宗文，袁静，罗擎颖，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44