一种检测环境中多环芳烃化学物的质粒及应用制造技术

本发明专利技术为一种检测环境中多环芳烃化学物的质粒及应用，涉及分子生物学及环境生物技术领域。本发明专利技术通过提取人源性AHR基因启动子，以含萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶双报告基因的CV060质粒为载体，插入特定序列的AHR基因启动子，构建了含AHR基因启动子的内参内置型双荧光素酶报告基因的重组慢病毒质粒。本发明专利技术的检测方法重复性好、灵敏度高、检测结果可靠，且操作简单方便，可广泛地应用于环境中多环芳烃类物质的检测。

【技术实现步骤摘要】
一种检测环境中多环芳烃化学物的质粒及应用
:本专利技术涉及分子生物学及环境生物
，具体地说，是涉及一种含人源性AHR基因启动子及双荧光素酶报告基因的重组质粒的构建方法,从而应用于环境中多环芳烃的存在及含量的检测。
技术介绍
：多环芳烃化合物(PolycyclicAromaticHydrocarbons，简称PAHs)是指分子中含有两个或两个以上苯环的一类碳氢化合物，主要来源于煤炭、石油、木材等有机物的裂解和不完全燃烧。目前已知的PAHs约有200种，广泛分布于人类生活的环境中。PAHs引起的环境污染越来越受到人们的重视，它已成为许多国家的优先监测物。1976年EPA列出了16项PAHs为优先控制污染物。1990年我国提出的68种水体优先控制污染物中有7种属于PAHs。多数的PAHs有致癌性，流行病学研究表明PAHs通过皮肤、呼吸道、消化道等均可被人体吸收，可诱发皮肤癌、肺癌、直肠癌、膀胱癌、白血病等（BoffettaP,JourenkovaN,GustavssonP.Cancerriskfromoccupationalandenvironmentalexposuretopolycyclicaromatichydrocarbons.CancerCausesControl,1997,8(3):444-472.）。一些PAHs还有免疫毒性、生殖和发育毒性。值得注意的是，绝大多数PAHs在体内的代谢产物，其致突变性和致癌性较之原型化学物强数十至数千倍，对人体造成的危害更为严重。PAHs毒性作用的机理为，PAHs可诱导机体细胞内芳香烃受体（AHR）的表达，同时作为配体与AHR结合使之激活，转位于核内后与核中的芳香烃受体核转位子蛋白（ARNT）结合，形成配体-AHR-ARNT复合体，然后结合于特异基因上游的芳香烃受体反应元件（AhRE），从而导致特异基因如细胞色素P4501A1和1A2等的表达增强，最终通过代谢活化产生毒性作用。由此可见，PAHs类化合物的毒性大小与其诱导AHR能力及活化受体结合AhRE的能力有密切相关性,因此测定PAHs类化学物诱导AHR的能力对于评估其毒性及环境浓度具有主要的参考价值。如何高效、快速地检测环境中的PAHs受到了国内外政府部门及相关科研工作者的关注。目前，环境中的PAHs的检测方法主要为化学和生物两大类方法：前者如分光光度法及色谱法，仪器设备大型昂贵、样本前处理复杂，且无法检测未知污染物；后者如细胞增殖实验等，过程繁琐、耗时长、且对操作人员有较高的技术要求，并且上述两种方法都不能准确表达该环境污染物的人体效应。本专利技术针对现有技术的不足，提供了一种简单、快速、灵敏的检测手段。PAHs进入人体后，激活芳烃受体（AHR），启动一系列下游生物学效应，从而发挥毒作用效应，因此，利用人源性AHR启动子构建的质粒检测环境中的PAHs，可优于直接的化学检测或简单的细胞增殖，反映化学物存在的同时，还能提示该类化合物对人类健康的潜在的损害效应。本专利技术针对现有技术的不足，提供了一种简单、快速、灵敏的检测手段。PAHs进入人体后，激活芳烃受体（AHR），启动一系列下游生物学效应，从而发挥毒作用效应，因此，利用人源性AHR启动子构建的质粒检测环境中的PAHs，可优于直接的化学检测或简单的细胞增殖，反映化学物存在的同时，还能提示该类化合物对人类健康的潜在的损害效应。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于提供一种含人源性AHR基因启动子及双荧光素酶报告基因的重组慢病毒质粒及其构建方法，从而应用于环境中多环芳烃类物质的检测。本专利技术通过以下技术方案实现上述目的：本专利技术利用人源性AHR基因启动子受到多环芳烃类物质上调的特性，建立一种通过检测多环芳烃类物质对上述启动子的激活情况，实现对环境中多环芳烃类物质检测的方法。本专利技术通过提取人AHR基因启动子，以含有萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶报告基因的CV060质粒为载体，插入AHR基因启动子，构建一种含有AHR基因启动子和双荧光素酶报告基因的重组慢病毒质粒。所述的人源性AHR基因的启动子序列见SEQIDNO:1。所述的AHR基因的启动子，获取该启动子使用的引物序列为：AHR-promoter-P1：TGGTTAATTAAGGCACTACACTATACTGTATTC，SEQIDNO:2；AHR-promoter-P2：CGGGCTAGCAACAGAGCGTCGACGGGACTC，SEQIDNO:3。所述的重组慢病毒质粒，其特征是含萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶报告基因，元件顺序为MCS-firefly_Luc-Tk-Renilla_Luc。所述的重组质粒中的AHR基因启动子序列长度为2111bp。本专利技术所述的含AHR基因启动子和双报告基因的重组质粒，其中的载体质粒和AHR基因启动子都含有PacI/和NheI双酶切位点。本专利技术通过以下方法和步骤构建所述的含有人源性AHR基因启动子和报告基因的重组质粒：1.制备含有AHR基因启动子基因组DNA（1）提取含有AHR基因启动子的基因组DNA；（2）扩增、纯化AHR基因启动子目的片段；2.大量制备慢病毒表达载体CV0603.构建稳定表达AHR基因启动子的重组质粒（1）含有AHR基因启动子目的片段和CV060载体质粒的双酶切；（2）酶切后的AHR基因启动子目的片段和CV060载体质粒的酶连；（3）筛选连接后的重组质粒并大量扩增制备。本专利技术的另一个目的是提供一种含上述重组慢病毒质粒的用途，所述的重组慢病毒质粒主要用于环境中多环芳烃类物质的检测。为了实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：将上述的重组慢病毒质粒，经慢病毒包装后，转染人293T细胞，多环芳烃类物质刺激转染后的人293T细胞，可以诱导AHR启动子的调控序列表达调控作用的蛋白，诱导表达荧光素酶，加入荧光素酶底物后，能够产生化学发光，检测双荧光素酶报告基因的活性,通过萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性比值来反映环境中多环芳烃类物质的存在，且比值大小严格受到诱导物含量的控制。本专利技术通过以下步骤实现含有AHR基因启动子的重组慢病毒质粒在环境中多环芳烃类物质的检测用途：1.含AHR基因启动子的重组质粒的慢病毒包装（1）将该重组质粒及其两种辅助包装原件载体质粒，共转染人293T细胞，收集转染后的细胞上清液，并进行浓缩；（2）测定病毒滴度；2.目的细胞的转染（1）将人293T细胞按一定的比例接种到细胞培养板中，培养过夜；（2）将制备的病毒液稀释至合适的滴度，转染人293T细胞；（3）转染8-12小时后，换新鲜的完全培养基，继续培养3-4天；3.分别加入待测样品、不同浓度的多环芳烃标准品处理转染后的细胞4.检测转染后的细胞的双荧光素酶报告基因活性（1）裂解经待检测样本、标准品处理24小时的293T细胞；（2）利用双报告基因检测试剂盒，检测双报告基因的活性；（3）根据双荧光素酶报告基因活性的比值大小，对照标准曲线可计算出待测样本中多环芳烃类物质的含量。本专利技术构建的重组慢病毒质粒具有以下优点：（1）双荧光素酶报告基因法具有灵敏度高、检测速度快、费用低的特点，且能克服转染效率对结果的影响；（2）萤火虫荧光素酶（报告基因）和海肾萤光素酶基因（内参基因）被置于同一载体上，各自含有独立的启动子，活性稳定本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种质粒，其特征在于用人源性AHR基因启动子连接内参内置型双荧光素酶报告基因的慢病毒载体，构建AHR过表达的重组慢病毒质粒。

【技术特征摘要】
1.一种质粒，其特征在于用人源性AHR基因启动子连接内参内置型双荧光素酶报告基因的慢病毒载体，构建AHR过表达的重组慢病毒质粒；所述的人源性AHR基因的启动子序列见SEQIDNO:1；所使用的内参内置型双荧光素酶报告基因的慢病毒载体为CV060，元件的顺序为MCS-firefly-Luc-Tk-Renilla-Luc，包含PacI和NheI双酶切位点。2.根据权利要求1所述的一种质粒，其特征在于所述的AHR基因的启动子，获取该启动子使用的引物序列为：TGGTTAATTAAGGCACTACACTATACTGTATTC，见SEQIDNO:2；CGGGCTAGCAACAGAGCGTCGACGGGACTC，见SEQIDNO:3。3.利用权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾爱华，严丽锋，吉贵祥，赵鹏，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32