MELK活性的生物标记物及使用其的方法技术

本申请的方法涉及以下意想不到的发现，人真核起始因子4B(eIF4B)的第406位(如，丝氨酸残基)的磷酸化水平，或其直系同源物的相应的磷酸化氨基酸，可以用作MELK酶(例如激酶)活性和/或致癌活性的生物标记物。本申请的方法还涉及以下意想不到的发现，人组蛋白H3的第3位(如，苏氨酸残基)和/或第10位(如，丝氨酸残基)和/或第11位(如，苏氨酸残基)或其直系同源物的相应的磷酸化氨基酸的磷酸化水平，也可以用作MELK酶(例如激酶)活性和/或致癌活性的生物标记物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本申请要求2014年3月17日提交的美国临时申请61/954,046以及2013年11月12提交的美国临时申请61/902,877的优先权。其全部内容在此通过引用并入。
技术介绍
蛋白激酶——母系胚胎亮氨酸拉链激酶(MELK)，已知其参与调节细胞周期进展、细胞增殖、细胞凋亡和mRNA剪接(Badouel et al.(2006)Cell Cycle 5:883-889and Badouel et al.(2010)Exp.Cell Res.316:2166-2173)。通过基因表达谱分析，MELK也被确认与多种癌症相关，包括乳腺癌、肺癌、膀胱癌、淋巴瘤和宫颈癌细胞以及动物模型中乳腺肿瘤的形成(Komatsu et al.(2013)Int.J.Oncol.42:478-506；Pickard et al.(2009)Breast Cancer Res.11:R60；Hebbard et al.(2010)Cancer Res.70:8863-8873；Lin et al.(2007)Breast Cancer Res.9:R17；WO 2004/031413；WO 2007/7013665；and WO 2006/085684)。尽管有这种关联，迄今并未进行MELK介导的肿瘤发生的功能分析，MELK介导的肿瘤发生的机制和(经延伸)用于确定调节这些肿瘤发生有用的试剂测定法也是未知的。这种理解的缺乏阻止了对可靠地报告MELK酶和/或致癌活性的生物标记物的鉴定。虽然已知某些靶向MELK的激酶活性的抑制剂(参见，例如，Chung et al.(2012)Oncotarget 3:1629-1640)，但是在领域中仍有对确认MELK介导的肿瘤发生的生物标记物有明确需求，以提供快速有效的手段来评估靶向MELK的抗癌疗法。专利技术概述本申请基于，至少部分基于发现人真核起始因子4B(eIF4B)的第406位(例如，丝氨酸残基)的磷酸化水平是母系胚胎亮氨酸拉链激酶(MELK)活性的可靠生物标记物，适合在临床前和临床上测量MELK酶活性。类似地，本申请基于，至少部分基于发现人组蛋白H3的第3位(例如，苏氨酸残基)和/或第10位(例如，丝氨酸残基)和/或第11位(例如，苏氨酸残基)的磷酸化水平是母系胚胎亮氨酸拉链激酶(MELK)活性的可靠生物标记物，适合在临床前和临床上测量MELK酶活性。一方面，提供了一种用于识别抑制人母系胚胎亮氨酸拉链激酶(MELK)或其直系同源物的激酶或致癌活性的试剂的方法，包括：a)用所述试剂接触包含i)人MELK或其直系 同源物和ii)人真核起始因子4B(eIF4B)或其直系同源物的样本，并且b)确定所述试剂抑制人eIF4B的第406位丝氨酸磷酸化或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的能力，其中磷酸化减少识别出该试剂抑制人MELK或其直系同源物的激酶或致癌活性。在一个实施方式中，通过将样品中人eIF4B中第406位丝氨酸磷酸化的量或人eIF4B直系同源物中相应的氨基酸磷酸化的量与对照进行比较，来确定对人eIF4B中所述第406位丝氨酸磷酸化或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的抑制。在另一个实施方式中，对照是指，相比于不存在试剂或样本接触试剂的较早时间点的量，样本中人eIF4B的第406位丝氨酸磷酸化的量或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量。在另一个实施方式中，通过将样本中人eIF4B的第406位丝氨酸磷酸化的量或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量与人eIF4B 406或其直系同源物总量的比率与对照进行比较，来确定对人eIF4B的第406位丝氨酸磷酸化或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的抑制。在另一个实施方式中，对照是指，相比于不存在试剂或在样本接触试剂的较早时间点的该比率，样本中406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B比率或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的比率。在另一个实施方式中，所述方法还包括确定从具有高度结构化的5'UTR的RNA翻译的蛋白质的量，任选地，其中所述蛋白质选自由骨髓细胞瘤癌基因(c-Myc)、凋亡蛋白X-连锁抑制剂(XIAP)和鸟氨酸脱羧酶(ODC1)的组成的组。在另一个实施方式中，所述方法还包括确定试剂是否直接结合到所述人eIF4B或其所述直系同源物，或所述人MELK或其所述直系同源物的步骤。在另一个实施方式中，样本选自由体外、离体和体内样本组成的组。在另一个实施方式中，样本包含细胞(例如，癌细胞，例如癌症选自由MELK或eIF4B扩增或过度表达的任意癌症、有MELK或eIF4B活化突变的任意癌症和MELK或eIF4B被其他激酶活化的任意癌症组成的组)。在另一个实施方式中，细胞是从受试者获取。在另一个实施方式中，样本选自由组织、全血、血清、血浆、颊刮、唾液、脑脊液、尿液、粪便和骨髓组成的组。在另一个实施方式中，406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B量或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量是通过使用特异性结合到406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B或相应的磷酸化人eIF4B直系同源物的试剂进行免疫测定来确定的(例如，放射免疫测定、Western印迹分析、邻位连接技术、免疫荧光测定法、酶免疫测定法、免疫沉淀测定法、化学发光法、免疫组织化学测定法、斑点印迹测定或狭缝印迹检测法)。在另一个实施方式中，酶免疫测定法是一种夹心酶联免疫测定法，其使用特异性地结合人eIF4B或相应的人eIF4B直系同源物的捕获抗体或片段和特异性地结合406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B或相应的磷酸化的人eIF4B直系同源物的检测抗体或片段。在另一个实施方式中， 所述人eIF4B或其直系同源物，和/或所述人MELK或其直系同源物，包括表1所列的核酸序列或氨基酸序列。在另一个实施方式中，试剂为小分子，或抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方式中，试剂将406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量降低至少50％。另一方面，提供了一种用于评估试剂在受试者体内抑制人MELK或其直系同源物激酶活性的疗效的方法，包括：a)第一个时间点检测在受试者样本中第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或在对应于人eIF4B氨基酸位点磷酸化的直系同源物的量；b)在施用试剂后的一个或多个后续时间点重复步骤a)；然后c)比较步骤a)和所述b)中第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或其直系同源物的量，其中与后续至少一个时间点相比，在第一时间点的第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或在对应于人eIF4B氨基酸位点磷酸化的直系同源物的量较高，表明试剂抑制人MELK或其直系同源物的激酶活性。在某些实施方式中，第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量通过免疫测定来确定，这种免疫测定使用的试剂能特异性地结合到第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B或相应的磷酸化的人eIF4B直系同源物(例如，放射免疫测定、Western印迹分析、邻位连接技术、免疫荧光测定法、酶免疫测定法、免疫沉淀测定法、化学发光法、免疫组织化学测定法、斑点印迹测定或狭缝印迹检测法)。在另一个实施方式中，酶免疫本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种识别抑制人母系胚胎亮氨酸拉链激酶(MELK)或其直系同源物的激酶活性或致癌活性的试剂的方法，包括：a)将包含i)人MELK或其直系同源物和ii)人真核起始因子4B(eIF4B)或其直系同源物的样本与所述试剂接触，并且b)确定所述试剂抑制人eIF4B的第406位丝氨酸磷酸化或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的能力，其中磷酸化减少识别出所述试剂抑制人MELK或其直系同源物的激酶活性或致癌活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.11.12 US 61/902,877;2014.03.17 US 61/954,0461.一种识别抑制人母系胚胎亮氨酸拉链激酶(MELK)或其直系同源物的激酶活性或致癌活性的试剂的方法，包括：a)将包含i)人MELK或其直系同源物和ii)人真核起始因子4B(eIF4B)或其直系同源物的样本与所述试剂接触，并且b)确定所述试剂抑制人eIF4B的第406位丝氨酸磷酸化或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的能力，其中磷酸化减少识别出所述试剂抑制人MELK或其直系同源物的激酶活性或致癌活性。2.根据权利要求1所述的方法，其中通过将样本中人eIF4B的所述第406位丝氨酸磷酸化的量或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量与对照进行比较，来确定所述对人eIF4B的第406位丝氨酸磷酸化或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的抑制。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述对照是，相比于未用所述试剂的情况下的或在将所述样本与所述试剂接触后的较早时间点的量，所述样本中第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的所述量。4.根据权利要求1所述的方法，其中通过将样本中人eIF4B的第406位丝氨酸磷酸化的量或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量相对于人E1F4B或其直系同源物的总量的比率与对照进行比较，来确定所述对人eIF4B的第406位丝氨酸磷酸化或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的抑制。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述对照是，相比于未用所述试剂的情况下的或将所述样本与所述试剂接触后的较早时间点的比率，所述样本中第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量的所述比率。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，还包括确定从具有高度结构化5’UTR的RNA翻译的蛋白质的量，任选地其中所述蛋白质选自由骨髓细胞瘤癌基因(c-Myc)、X染色体连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)和鸟氨酸脱羧酶(ODC1)组成的组。7.根据权利要求1所述的方法，还包括确定所述试剂是否直接结合所述人eIF4B或其直系同源物，或所述人MELK或其直系同源物的步骤。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述样本选自由体外、离体和体内样本组成的组。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述样本包含细胞。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述细胞是癌细胞。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述癌症选自由MELK或eIF4B扩增或过度表达的任意癌症、具有活化的MELK或eIF4B突变的任意癌症和MELK或eIF4B被其他激酶活化的任意癌症组成的组。12.根据权利要求9所述的方法，其中所述细胞从受试者获取。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述样本选自由组织、全血、血清、血浆、颊刮、唾液、脑脊液、尿液、粪便和骨髓组成的组。14.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量是通过使用特异性与第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B或相应的磷酸化人eIF4B直系同源物结合的反应剂进行免疫测定来确定的。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述免疫测定是放射免疫测定、Western印迹分析、邻位连接技术、免疫荧光测定法、酶免疫测定法、免疫沉淀测定法、化学发光法、免疫组织化学测定法、斑点印迹测定或狭缝印迹检测法。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述酶免疫测定法是一种夹心酶联免疫测定法，所述夹心酶联免疫测定法使用特异性结合人eIF4B或相应的人eIF4B直系同源物的捕获抗体或其片段和特异性结合第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B或相应的磷酸化的人eIF4B直系同源物的检测抗体或其片段。17.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述人eIF4B或其直系同源物，和/或所述人MELK或其直系同源物，包括如表1所列的核酸序列或氨基酸序列。18.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述试剂为小分子，或抗体或其抗原结合片段。19.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述试剂将第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量降低至少50％。20.一种用于评估试剂在受试者中抑制人MELK或其直系同源物的激酶活性的效果的方法，包括：a)在第一个时间点检测受试者样本中第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或相应的氨基酸磷酸化的人eIF4B直系同源物的量；b)在施用所述试剂后的一个或多个后续时间点重复步骤a)；和c)比较步骤a)和步骤b)中检测的磷酸化的人eIF4B的量或其直系同源物的量，其中第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或相应的氨基酸磷酸化的人eIF4B直系同源物的量在第一时间点高于至少一个后续时间点，表明所述试剂抑制人MELK或其直系同源物的激酶活性。21.根据权利要求20所述的方法，其中第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量通过免疫测定确定，所述免疫测定使用特异性结合第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B或相应的磷酸化的人eIF4B直系同源物的反应剂。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述免疫测定是放射免疫测定、Western印迹分析、邻位连接技术、免疫荧光测定法、酶免疫测定法、免疫沉淀测定法、化学发光法、免疫组织化学测定法、斑点印迹测定或狭缝印迹检测法。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述酶免疫测定法是一种夹心酶联免疫测定法，所述夹心酶联免疫测定法使用特异性结合人eIF4B或相应的人eIF4B直系同源物的捕获抗体或其片段和特异性结合第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B或相应的磷酸化的人eIF4B直系同源物的检测抗体或其片段。24.根据权利要求20所述的方法，其中所述样本选自由离体和体内样本组成的组。25.根据权利要求20所述的方法，其中所述样本包含癌细胞。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述癌细胞是选自由MELK或eIF4B扩增或过度表达的任意癌症、有活化的MELK或eIF4B突变的任意癌症和MELK或eIF4B被其他激酶活化的任意癌症组成的组的细胞。27.根据权利要求20所述的方法，其中所述样本选自由组织、全血、血清、血浆、颊刮、唾液、脑脊液、尿液、粪便和骨髓组成的组。28.根据权利要求20所述的方法，其中所述步骤a)和/或步骤b)中的样本是获自所述受试者的单一样本的一部分。29.根据权利要求20所述的方法，其中所述步骤a)和/或步骤b)中的样本是获自所述受试者的合并样本的一部分。30.根据权利要求20所述的方法，其中在所述第一时间点和所述后续时间点之间，所述受试者已经接受癌症治疗、已完成癌症治疗和/或处于癌症缓解期。31.根据权利要求20所述的方法，其中所述人eIF4B或其直系同源物，和/或所述人MELK或其直系同源物，包括如表1所列的核酸序列或氨基酸序列。32.根据权利要求20所述的方法，其中所述试剂为小分子，或抗体或其抗原结合片段。33.根据权利要求20所述的方法，其中所述试剂将第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量降低至少50％。34.一种用于治疗患有癌症的患者的方法，包括向所述受试者施用抑制人eIF4B的第406位丝氨酸磷酸化或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的试剂，从而治疗所述患有癌症的患者。35.根据权利要求34所述的方法，其中所述试剂是以药学上可接受的剂型施用的。36.根据权利要求34所述的方法，其中所述试剂为小分子，或抗体或其抗原结合片段。37.根据权利要求34所述的方法，其中所述试剂直接结合所述人eIF4B或其直系同源物，或所述人MELK或其直系同源物。38.根据权利要求34所述的方法，其中所述癌症选自由MELK或eIF4B扩增或过度表达的任意癌症、有活化的MELK或eIF4B突变的任意癌症和MELK或eIF4B被其他激酶活化的任意癌症组成的组。39.根据权利要求34所述的方法，其中所述人eIF4B或其直系同源物，和/或所述人MELK或其直系同源物，包括如表1所列的核酸序列或氨基酸序列。40.根据权利要求34所述的方法，其中所述试剂为小分子，或抗体或其抗原结合片段。41.根据权利要求34所述的方法，其中所述试剂将第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量降低至少50％。42.根据权利要求34所述的方法，还包括施用一种或多种另外的抗癌剂。43.一种用于确定人MELK或其直系同源物的功能或活性的方法，包括：a)检测样本中第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或相应的氨基酸磷酸化的人eIF4B直系同源物的量；b)在操作所述样本后和/或在操作相同样本或测试样本后，在相同样本或测试样本中一个或多个后续时间点重复步骤a)；和c)比较步骤a)和步骤b)中检测的第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或相应的氨基酸磷酸化的人eIF4B直系同源物的量，其中第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或人eIF4B的相应的氨基酸磷酸化的人eIF4B直系同源物的量在第一时间点相比于至少一个后续时间点和/或至少一个后续的对相同样本或测试样本的操作发生改变，表明人MELK或其直系同源物的功能或活性发生改变。44.根据权利要求43所述的方法，其中第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量通过免疫测定来确定，这种免疫测定使用特异性地结合第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B或相应的磷酸化的人eIF4B直系同源物的反应剂。45.根据权利要求44所述的方法，其中所述免疫测定是放射免疫测定、Western印迹分析、邻位连接技术、免疫荧光测定法、酶免疫测定法、免疫沉淀测定法、化学发光法、免疫组织化学测定法、斑点印迹测定或狭缝印迹检测法。46.根据权利要求45所述的方法，其中所述酶免疫测定法是一种夹心酶联免疫测定法，所述夹心酶联免疫测定法使用特异性结合人eIF4B或相应的人eIF4B直系同源物的捕获抗体或其片段和特异性结合第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B或相应的磷酸化的人eIF4B直系同源物的检测抗体或其片段。47.根据权利要求43所述的方法，其中所述样本选自由体外、离体和体内样本组成的组。48.根据权利要求43所述的方法，其中所述样本包括细胞或所述方法使用基于细胞的测定法。49.根据权利要求48所述的方法，其中所述细胞是选自由MELK或eIF4B扩增或过度表达的任意癌症、有活化的MELK或eIF4B突变的任意癌症和MELK或eIF4B被其他激酶活化的任意癌症组成的组的癌细胞。50.根据权利要求43所述的方法，其中样本选自由组织、全血、血清、血浆、颊刮、唾液、脑脊液、尿液、粪便和骨髓组成的组。51.根据权利要求43所述的方法，其中所述步骤a)和/或步骤b)中的所述相同样本或测试样本是获自所述受试者的单一样本的一部分。52.根据权利要求43所述的方法，其中所述步骤a)和/或步骤b)中的所述相同样本或测试样本是获自所述受试者的合并样本的一部分。53.根据权利要求43所述的方法，其中在所述第一时间点和所述后续时间点之间，所述受试者已经接受癌症治疗、已完成癌症治疗和/或处于癌症缓解期。54.根据权利要求43所述的方法，其中所述人eIF4B或其直系同源物，和/或所述人MELK或其直系同源物，包括如表1所列的核酸序列或氨基酸序列。55.根据权利要求43所述的方法，其中对所述样本的操作选自由将所述样本与测试试剂接触，将所述样本与MELK信号通路的上游信号接触，和将所述样本与MELK抑制剂接触组成的组。56.根据权利要求55所述的方法，其中所述测试试剂为小分子，或抗体或其抗原结合片段。57.根据权利要求55或56所述的方法，其中所述测试试剂将第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量降低至少50％。58.一种用于识别抑制人MELK或其直系同源物激酶活性或致癌活性的试剂的方法，包括：a)将包含i)人MELK或其直系同源物和ii)人组蛋白H3或其直系同源物的样本与所述试剂接触；并且b)确定所述试剂抑制人组蛋白H3的第3位苏氨酸磷酸化或其直系同源物中相应的磷酸化氨基酸；和/或人组蛋白H3的第10位丝氨酸磷酸化或其直系同源物中相应的磷酸化氨基酸；和/或人组蛋白H3的第11位苏氨酸磷酸化或其直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的能力，其中减少的磷酸化识别出抑制人MELK或其直系同源物的激酶活性或致癌活性的试剂。59.根据权利要求58所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·赵，Y·王，
申请(专利权)人：丹娜法伯癌症研究院，
类型：发明
国别省市：美国;US