一种沉默T细胞抗原受体的T淋巴细胞的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种沉默T细胞抗原受体的T细胞制备方法，本发明专利技术是一种RNA干扰技术，特别是双靶点干扰技术沉默T细胞抗原受体，本发明专利技术还涉及表达shRNA的T细胞，所述T细胞可沉默自身的T细胞抗原受体，对异体来源的组织降低排斥作用。

【技术实现步骤摘要】
一种沉默T细胞抗原受体的T淋巴细胞的制备方法
本专利技术涉及生物与新医药
，更具体的说，是一种沉默T细胞抗原受体的T淋巴细胞的制备方法。
技术介绍
T淋巴细胞是在胸腺中分化成熟的淋巴细胞，故称胸腺依赖性淋巴细胞(Thymus-dependentlymphocyte)，简称T细胞。T细胞是由胸腺内的淋巴干细胞分化而成，是淋巴细胞中数量最多，功能最复杂的一类细胞。T细胞膜表面分子与T细胞的功能相关，也是T细胞的表面标志，可以用以分离、鉴定不同亚群的T细胞。TCR为所有T细胞表面的特征性标志，以非共价键与CD3结合，形成TCR-CD3复合物。TCR的作用是识别抗原。TCR是由两条不同肽链构成的异二聚体，由α、β两条肽链组成，每条肽链又可分为胞外区、跨膜区和胞质区等几部分；其特点是胞质区很短。TCR分子属于免疫球蛋白超家族，其抗原特异性存在于胞外区。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，是一种特异性的转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencingandtransgenesilencing)。由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特异地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。RNAi技术可广泛应用到包括功能学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。机体对内外的各种致病因子有着非常完善的防御机制，其中对外来物如细菌、病毒、异物等“异己成分”的重要作用，就是攻击、破坏、清除。这主要是由于T细胞抗原受体的识别作用。每个机体内的T细胞抗原受体都是特异的，遇到来源于异体的T细胞时会发生免疫反应。而在细胞免疫治疗技术的应用中，当病人因身体虚弱，导致自体外周血中T细胞数量比较少，很难在体外诱导成CIK细胞，因此，应用异体T细胞对病人免疫治疗具有潜在优势。
技术实现思路
为了弥补以上不足，本专利技术提供了一种沉默T细胞抗原受体的T淋巴细胞的制备方法，本专利技术为一个双靶点的RNA干扰技术，表达所述双靶点RNAi的T淋巴细胞，以及所述T淋巴细胞用于异体回输降低排斥反应的用途。本专利技术的方案是：一种沉默T细胞抗原受体的T细胞制备方法，在TCR的α链和β链基因中分别选取连续的21个核苷酸，并与相应的启动子序列依次连接起来，得到转录形成TCR-RNAi的融合基因片段，将所构建的融合基因片段插入慢病毒表达载体，包装成携带TCR-RNAi融合基因的慢病毒，将所述携带TCR-RNAi融合基因的慢病毒感染单核细胞诱导的异质T淋巴细胞，得到沉默T细胞抗原受体的T淋巴细胞。作为优选的技术方案，所述的转录TCR-RNAi的融合基因片段为序列表SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列。作为优选的技术方案，所述单核细胞诱导的异质T淋巴细胞如下制备：取脐带血，分离单核细胞，用含有重组干扰素的培养基诱导培养24小时后，加入重组白细胞介素、OKT-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养24小时；每隔三天倍比加液，培养至第17天，流式细胞术检测CIK细胞的分子标记TCR+的阳性表达率；当TCR+阳性率>90％，收获由单核细胞诱导的异质T淋巴细胞。作为优选的技术方案，将所述携带TCR-RNAi融合基因的慢病毒感染单核细胞诱导的异质T淋巴细胞如下制备：所述携带TCR-RNAi融合基因的慢病毒转染293T细胞后，所述293T细胞释放慢病毒颗粒，所述慢病毒颗粒感染单核细胞诱导的异质T淋巴细胞。作为优选的技术方案，所述转录TCR-RNAi融合基因片段如下制取：通过基因合成技术将选取的TCR中的α链和β链的21个核苷酸，H1启动子，U6启动子与酶切位点的核苷酸序列构成融合基因TCR-RNAi。本专利技术还提供了一种治疗肿瘤可以异体回输的药物，含有权利要求1所述的沉默T细胞抗原受体的T细胞。本专利技术设计的沉默T细胞抗原受体的T细胞，能够大大降低机体的排斥反应，达到异体回输的目的，提高沉默效果。本专利技术的优点由于双靶点RNAi的基因沉默效率要比单靶点RNAi高，本专利技术利用双靶点RNAi来沉默TCR基因，通过磁珠筛选，去除未沉默TCR的T细胞。在异体回输时，不减弱T细胞杀伤肿瘤细胞的能力同时避免引起严重的排斥反应。本专利技术中沉默T细胞抗原受体的T淋巴细胞的各模块(1)TCR-RNAi基因本专利技术中提供了一个双靶点RNAi载体构建方法，双靶点RNAi可以提高基因沉默的效率。RNAi基因中使用的是H1启动子和U6启动子，分别连在两条不同的链上，并与酶切位点相连，设计图见图1。(2)重组病毒表达载体本专利技术中使用的载体是慢病毒载体pLent-C-GFP，pLent-N-GFP表达基因载体含有一个原始复制子(originofreplication)，一个巨细胞病毒的启动子序列(CMV)，和限制性内切酶位点(NotI，AsiSI等)，选择性的抗性基因(抗氨苄青霉素)及标签蛋白(绿色荧光蛋白)。通过人工合成的TCR-RNAi基因，即目标DNA，在T4连接酶作用下，与载体DNA连接，形成转录RNAi的完整载体pLent-TCR-RNAi见图2。(3)宿主细胞本专利技术所用的宿主细胞为一种异质T淋巴细胞—CIK(多种细胞因子诱导的杀伤细胞，cytokine-inducedkiller)。CIK是将脐血单核细胞在体外用多种细胞因子(如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ等)共同培养一段时间后获得的一群细胞。CIK细胞中的效应细胞在正常人外周血中极少，仅1％～5％。相对与普通的T淋巴细胞，本专利技术具有以下优势：(1)细胞增殖速度快；(2)CIK具有识别肿瘤的机制，对正常的细胞无毒性作用；(3)杀瘤谱广，可用于白血病、肝癌、肾癌、胃癌、直肠癌等多种肿瘤的治疗；(4)典型的生物治疗模式，通过沉默T细胞受体基因工程方法改良CIK细胞，可对肿瘤进行异体杀伤，开启普遍性。本专利技术中沉默掉T细胞受体的T细胞，可以是自体的T细胞，也可以是异体的T细胞。所用T细胞的数量为0.5×106～1×109/Kg。通常所用的T细胞的剂量为0.5×106-1.0×107/kg。附图说明图1为双靶点RNAi的基因片段的设计图；图2为本专利技术所述的慢病毒表达质粒(pLent-TCR-RNAi)的示意图，其中，顺时针序列为正向基因片段，逆时针为反向基因片段；图3是本专利技术脐血淋巴细胞诱导的CIK倒置显微镜下视野图；图4是本专利技术脐血淋巴细胞诱导的CIK的表面分子标记TCR+表达的流式图(TCR表达率为97.9％)；图5是本专利技术所述的293T细胞明视野图；图6是显微镜下观察慢病毒表达质粒(pLent-TCR-RNAi)转染293T细胞的转染效率图；图7是本专利技术所述病毒感染T细胞倒置显微镜下视野图；图8是流式细胞术分析经过磁珠分离后的T细胞的TCR+的效率为4.5％。具体实施方式为了使本专利技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。下面将结合实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种沉默T细胞抗原受体的T细胞制备方法，其特征在于：在TCR的α链和β链基因中分别选取连续的21个核苷酸，并与相应的启动子序列依次连接起来，得到转录形成TCR‑RNAi的融合基因片段，将所构建的融合基因片段插入慢病毒表达载体，包装成携带TCR‑RNAi融合基因的慢病毒，将所述携带TCR‑RNAi融合基因的慢病毒感染单核细胞诱导的异质T淋巴细胞，得到沉默T细胞抗原受体的T淋巴细胞。

【技术特征摘要】
1.一种沉默T细胞抗原受体的T细胞制备方法，其特征在于：在TCR的α链和β链基因中分别选取连续的21个核苷酸，并与相应的启动子序列依次连接起来，得到转录形成TCR-RNAi的融合基因片段，将所构建的融合基因片段插入慢病毒表达载体，包装成携带TCR-RNAi融合基因的慢病毒，将所述携带TCR-RNAi融合基因的慢病毒感染单核细胞诱导的异质T淋巴细胞，得到沉默T细胞抗原受体的T淋巴细胞。2.如权利要求1所述的一种沉默T细胞抗原受体的T细胞的制备方法，其特征在于：所述的转录TCR-RNAi的融合基因片段为序列表SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列。3.如权利要求1所述的一种沉默T细胞抗原受体的T细胞的制备方法，其特征在于，所述单核细胞诱导的异质T淋巴细胞如下制备：取脐带血，分离单核细胞，用含有重组干扰素的培养基诱导培养24小时后，加入重组白细胞介素、OKT-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养24小时；每...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘明录，金海峰，强邦明，万磊，韩庆梅，冯建海，张传鹏，马洪华，
申请(专利权)人：山东兴瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37