MMHRL3转基因小鼠肝肿瘤细胞系的建立及应用制造技术

本发明专利技术提供了H‑

【技术实现步骤摘要】
MMHRL3转基因小鼠肝肿瘤细胞系的建立及应用
本专利技术涉及生物学和肿瘤学领域，更具体地涉及新型H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞系MMHRL3、及建立方法和应用。
技术介绍
人类疾病的发生和发展是一个非常复杂的过程。深入研究各类疾病的发病机制及临床药物治疗效果，以达到预防和治愈各种疾病的目的，是人类坚持不懈的奋斗目标。但基于人道主义，不能采用直接对患者进行实验的方法。而遵循动物保护法，可以通过动物实验对各类疾病发生发展的规律和生命现象进行深入研究，以便达到控制人类疾病的发生发展进程，缓解患者的病痛，直至治愈疾病的目的。在人类长期的摸索实践中发现，临床疾病研究将健康人体和患病人体作为研究对象难以推动医学的快速和深入发展，而且存在人文、伦理、道德等诸多问题。另外，临床疾病研究还存在大量样本积累和长时间观察等局限性。人类疾病动物模型(Animalmodleofhumandiseases)是指生物医学研究中建立的具有人类疾病表现的实验动物和材料。通过人类疾病动物模型研究人类疾病的发生和发展规律以及治疗措施是现代生物医学研究中至关重要的实验方法和手段。其中，细胞培养已有百余年的历史，是进行体外基础医学研究的重要方法。随着人们生活方式的改变、社会工业化进程和寿命的延长，肿瘤发病率也随之升高，已成为威胁人类生命健康的主因之一。肝癌号称“癌中之王”，是我国重点的防治病患，但其病因繁多、过程复杂、治愈率差，机制尚不清楚，仍有待于深入阐明。目前，建立的人类肝癌细胞系已有数十种之多，但由于各个肝癌细胞系的来源背景复杂，分子机制各异，不利于对病因进行精准分析。另外，这些细胞系还存在成瘤能力有限、传代不稳定等不足，也不利于肝肿瘤的基础研究。小鼠是典型的人类疾病动物模型，可以通过建立单一病因诱发的原发性肝肿瘤动物模型对肝癌的病因学进行深入剖析。但由于小鼠的体内实验费用高、耗时耗力，并且影响因素复杂，急需建立相应的小鼠肝肿瘤细胞系。但相比之下，小鼠肝肿瘤细胞系的建立较为困难。因此，目前可应用的小鼠肝肿瘤细胞系屈指可数。所以，本研究领域迫切需要研发病因明确、传代稳定、高成瘤性、适用于建立多种动物模型的小鼠肝肿瘤细胞系。
技术实现思路
本专利技术目的在于为肝肿瘤基础研究和临床治疗提供一种肝肿瘤细胞系，该细胞系具有传代稳定、成瘤性好、适用于建立多种肝肿瘤动物模型。本专利技术的另一个目的在于提供所述的H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞系的制备方法以及用途。在本项专利技术的第一方面，提供了一种H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞，所述肝肿瘤细胞是H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL3，它保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:C2016192。在本专利技术的第二方面，提供了本专利技术第一方面中所描述的H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞的子代细胞，所描述子代细胞能够导致裸鼠形成肝肿瘤。在另一优选例中，所描述的子代细胞基本保留或完全保留亲代H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL3的特性。在另一优选例中，所述的H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL3或其子代细胞具有如下特性：(a)100％细胞表达H-ras12V转基因；(b)具有免疫缺陷小鼠皮下成瘤能力。在本项专利技术的第三方面，提供了本专利技术上述的H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHR1或其子代细胞的用途，它们可以被应用于裸鼠体内产生肝肿瘤。在本专利技术的第四方面，提供了一种建立肝肿瘤动物模型的方法，包括步骤：(a)将2×106-1×108的本专利技术上述的H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL3或其子代细胞接种于裸鼠体内；(b)饲养步骤(a)的裸鼠15-100天，获得肝肿瘤动物模型。在另一优选例中，所述的接种是接种于以下部位：肝脏、腹腔、尾静脉、皮下部位或者其组合。在另一优选例中，步骤(b)中培养裸鼠7-100天，获得肝肿瘤动物模型。在本项专利技术的第五方面，提供了一种体外培养肝肿瘤细胞的方法，包括步骤：在合适的培养基中培养本专利技术上述的H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL3或其子代细胞。在本专利技术的第六方面，提供了一种筛选治疗肝肿瘤的候选药物的方法，它包括步骤：(a)将2×106-1×108的本专利技术上述的H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL3或其子代细胞接种于裸鼠；(b)饲养步骤(a)的裸鼠15-100天，获得肝肿瘤动物模型；(c)将测试药物应用于步骤(b)中获得的肝肿瘤动物模型，并与未应用药物的步骤(b)中获得的肝肿瘤动物模型进行比较，其中应用后导致肝肿瘤症状改善或治愈的测试药物就是治疗肝肿瘤的候选药物。在另一优选例中，在步骤(c)中，将测试化合物的用药方式有如下选择：局部给药于肝肿瘤病灶部位、静脉给药、口服给药。在本专利技术的第七方面，提供了用本专利技术上述方法制备的形成的肝肿瘤模型动物。应理解，在本专利技术范围内，本专利技术的上述各项技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以相互组合，从而构成新的或优选的技术方案，限于篇幅，在此不再一一描述。附图说明图1显示了本专利技术H-ras12V转基因雄性小鼠细胞系MMHRL3的培养情况。图1A显示了半干法培养8天时细胞爬出肝肿瘤组织块形成肿瘤细胞团的情况(200×)；图1B显示了本专利技术H-ras12V转基因雄性小鼠细胞系MMHRL3细胞培养至第25代的生长形态(200×)。图2显示了本专利技术H-ras12V转基因雄性小鼠细胞系MMHRL3的细胞形态及增殖情况。图2A显示了本专利技术H-ras12V转基因雄性小鼠细胞系MMHRL3的细胞形态(400×),；图2B显示了本专利技术H-ras12V转基因雄性小鼠细胞系MMHRL3的增殖情况。图3显示了本专利技术H-ras12V转基因雄性小鼠细胞系MMHRL3的H-ras12V转基因的基因型鉴定和表达水平的检测。图4显示了本专利技术H-ras12V转基因雄性小鼠细胞系MMHRL3的信号通路活化水平的WesternBlot检测结果。图5显示了本专利技术H-ras12V转基因雄性小鼠细胞系MMHRL3皮下接种裸鼠成瘤的实验结果。具体实施方式本专利技术人经过广泛而深入的研究，对一只H-ras12V转基因雄性小鼠的肝肿瘤样本进行原代培养，最后建立了具有无限增殖能力的H-ras12V转基因雄性小鼠细胞系MMHRL3。在此基础上完成了本项专利技术。具体而言，本专利技术人将一只H-ras12V转基因雄性小鼠的肝肿瘤组织进行体外培养，建立相应的体外细胞系。对细胞系进行相关的生物学检测鉴定。筛选得到一种纯种H-ras12V转基因雄性小鼠细胞系MMHRL3。该细胞系生长稳定(已经稳定传代至75代)，并且该细胞系在光学显微镜下的形态学特征均一。动物学实验表明，该H-ras12V转基因雄性小鼠细胞系MMHRL3接种于裸鼠后可导致裸鼠产生肿瘤，其组织病理形态学与H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤组织相一致。本专利技术的H-ras12V转基因雄性小鼠细胞系MMHRL3不仅能够制备肝肿瘤动物模型，而且能够用于筛选治疗肝肿瘤的候选药物。一种优选的筛选治疗肝肿瘤(或肝肿瘤细胞生长)的候选药物的方法，包括步骤：(a)在测试组中，在H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL3的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞，其特征在于，所述肝肿瘤细胞是H‑ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL3，它保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C2016192。

【技术特征摘要】
1.一种转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞，其特征在于，所述肝肿瘤细胞是H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL3，它保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:C2016192。2.如权利要求1所述的H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞的子代细胞，其特征在于，所述子代细胞能够导致裸鼠形成肝癌。3.如权利要求1所述的H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞或权利要求2所述的子代细胞，其特征在于，所述细胞具有以下特征：(a)100％细胞表达H-ras12V转基因；(b)具有免疫缺陷小鼠皮下成瘤能力。4.如权利要求1所述的H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞或权利要求2所述的子代细胞的用途，其特征在于，用于在裸鼠。5.一种建立肝肿瘤动物模型的方法，其特征在于，包括步骤：(a)将2×106-1×108的权利要求1所述的H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞或权利要求2所述的子代细胞接种于裸鼠；...

【专利技术属性】
技术研发人员：王爱国，樊婷婷，刘要甫，王靖宇，王福金，
申请(专利权)人：大连医科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21