农杆菌介导的棉花胚尖快速转化方法技术

本发明专利技术提供一种农杆菌介导的棉花胚尖快速转化方法，首次采用吸胀但未萌发的胚尖作为外植体材料，经农杆菌侵染、共培养、筛选、生根、移栽等步骤，获得转基因棉花植株。本方法具有操作简单、转化周期短的优点。利用本方法在4个月即可获得转化植株，而常规棉花转化周期一般为5个月以上，本方法大大缩短了转基因棉花的获取周期，提高了转化效率。另外，利用本方法进行转化不受棉花基因型限制，为实现大规模转基因棉花生产、育种提供了可能。

Agrobacterium mediated rapid transformation of embryo tip of cotton

The invention provides an Agrobacterium mediated cotton embryo tip rapid transformation method, for the first time by imbibition but not germination of embryo explants. Materials by Agrobacterium infection, co culture, screening, rooting and transplanting steps to obtain transgenic cotton plants. The method has the advantages of simple operation and short conversion period. The transgenic plants can be obtained by using this method in 4 months, while the conventional cotton transformation cycle is usually more than 5 months. This method greatly shortens the acquisition cycle and improves the transformation efficiency of transgenic cotton. In addition, the transformation is not restricted by cotton genotypes, and it is possible to realize large-scale transgenic cotton production and breeding.

【技术实现步骤摘要】
农杆菌介导的棉花胚尖快速转化方法
本专利技术涉及植物转基因
和作物遗传育种领域，具体地说，涉及一种农杆菌介导的棉花胚尖快速转化方法。
技术介绍
棉花是重要的经济作物，自1987年Umbec等首次报道将外源基因成功导入陆地棉以来，目前棉花转基因技术主要采用基因枪法和农杆菌介导法。基因枪法因转化效率低，设备成本较高，且转基因拷贝数偏高，不利于进行商业化育种。王振怡等通过基因枪介导棉花转化，得到1.6％的转化效率。农杆菌介导法进行转基因棉花实验，受体材料的种类较多，可以利用棉花下胚轴、子叶、萌发数天的茎尖为侵染材料。下胚轴及子叶可通过愈伤组织诱导途径诱导胚状体的形成，是目前较常用的方法。但该方法转化周期长，体细胞无性系变异严重，转化效率低，且对品种的依赖性很高。易于转化的品种例如，YZ1等转化周期长达6个月。李燕娥等用农杆菌转化棉花品系9422的下胚轴，耗时4-5个月才获得转基因植株。常规的农杆菌侵染茎尖的方法，需将棉花先进行萌发，取幼苗的茎尖作为外植体材料，其缺点包括形成抗性芽少，易形成嵌合体，转化效率低等。因此，开发适合商业化生产的棉花品种的高效稳定的转基因方法，对于加快棉花的遗传育种进程意义重大。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种适用于工业化规模的向棉花中导入外源基因的高效转基因方法，即农杆菌介导的棉花胚尖快速转化方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供的农杆菌介导的棉花胚尖快速转化方法，包括以下步骤：(1)将棉花种子去绒灭菌后，浸泡于MSB培养基中，使其吸胀，然后在无菌条件下剥去吸胀的种皮，除去两片子叶，使胚尖裸露，放入含有FM培养基的离心管中，准备侵染；(2)将胚尖浸入携带外源目的基因和标记基因质粒的农杆菌菌液中侵染，辅以超声波处理；(3)将胚尖移至共培养培养基上进行共培养；(4)将胚尖移至恢复培养基上培养；(5)将胚尖移至筛选培养基上培养，诱导抗性芽的形成；(6)抗性芽在生根培养基上生根后炼苗、移栽，得到转基因棉花植株。所述MSB培养基的组成如下：MS基本培养基4.0-5.2g/L+维生素B5培养基0.8-1.2mg/L+葡萄糖酸钙1.0-1.5g/L。其中，维生素B5培养基的组成如下：肌醇100mg/L+盐酸硫胺素10mg/L+盐酸吡哆素1mg/L+烟酸1mg/L。MS基本培养基见表1。表1MS基本培养基的配方所述FM培养基的组成如下：硫酸镁0.1g/L+硝酸钾1g/L+硫酸铵53.6mg/L+磷酸氢钠52.2mg/L+氯化钙60mg/L+硼酸0.3mg/L+硫酸锰1mg/L+硫酸锌0.2mg/L+碘化钾0.075mg/L+钼酸钠0.025mg/L+氯化钴2.5μg/L+硫酸铜1.6μg/L+Na2·EDTA2.8mg/L+葡萄糖30g/L+MES(2-吗啉乙磺酸)3.9g/L+肌醇10mg/L+烟酸0.1mg/L+维生素B60.1mg/L+维生素B10.1mg/L+乙酰丁香酮292.4mg/L。所述共培养培养基中含有终浓度为0.1-400mg/L的半胱氨酸；优选含有终浓度为200mg/L的半胱氨酸。所述筛选培养基中含有终浓度分别为1-2mg/L的6-苄氨基嘌呤和0.01-0.1mg/L的萘乙酸；优选含有终浓度分别为1mg/L的6-苄氨基嘌呤和0.1mg/L的萘乙酸。前述的方法，步骤(1)中棉花种子去绒灭菌的具体方法为：将棉花种子用95％浓硫酸浸泡脱去表面短绒，然后用清水冲洗，晾干；将种子用75％乙醇浸泡10-15分钟，弃掉乙醇，然后浸泡于20％过氧化氢中，在100rpm摇床上室温震荡1-2小时，最后用无菌水冲洗3-5次。前述的方法，步骤(2)中使用农杆菌EHA105，所述农杆菌菌液的OD660值0.1-1.0，优选OD660值0.9。前述的方法，步骤(2)将胚尖浸入农杆菌菌液中，用10-150瓦超声波处理1-10分钟(优选100瓦超声波处理2分钟)，然后转入23℃，100rpm摇床中侵染2小时。前述的方法，步骤(3)将侵染后的胚尖移至FM培养基上共培养，于23℃，16小时光照/8小时黑暗共培养2-4天(优选3天)。前述的方法，步骤(4)中培养条件为：36℃，16小时光照/8小时黑暗，培养3天，然后于25℃光照培养室内培养4天。前述的方法，步骤(2)中所述质粒为pZZ00090，该质粒含有壮观霉素抗性基因aadA以及编码绿色荧光蛋白的报告基因GFP，质粒结构示意图见图1，其全序列如SEQIDNO:1所示。优选地，所述共培养培养基的组成如下：FM+半胱氨酸0.1-400mg/L+琼脂4g/L；所述恢复培养基的组成如下：MSB+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.1mg/L+羧苄青霉素100mg/L+头孢霉素100mg/L+琼脂4g/L；所述筛选培养基的组成如下：MSB+6-苄氨基嘌呤1-2mg/L+萘乙酸0.01-0.1mg/L+羧苄青霉素100mg/L+头孢霉素100mg/L+壮观霉素100mg/L+琼脂4g/L；所述生根培养基的组成如下：MSB+羧苄青霉素100mg/L+头孢霉素100mg/L。本专利技术进一步提供用于培育转基因棉花的培养基组合，包括共培养培养基、恢复培养基、筛选培养基和生根培养基。其中，所述共培养培养基中含有终浓度为0.1-400mg/L(优选200mg/L)的半胱氨酸；所述筛选培养基中含有终浓度分别为1-2mg/L的6-苄氨基嘌呤和0.01-0.1mg/L的萘乙酸，优选含有终浓度分别为1mg/L的6-苄氨基嘌呤和0.1mg/L的萘乙酸。本专利技术中涉及的棉花品种包括但不限于Coker312、鄂棉24。本专利技术采用由农杆菌介导的棉花转化方法，首次将吸胀但未萌发的胚尖作为外植体材料，经农杆菌侵染、共培养、筛选、生根、移栽等步骤，获得转基因棉花植株。本方法具有操作简单、转化周期短的优点。利用本方法在4个月即可获得转化植株，而常规棉花转化周期一般为5个月以上，本方法大大缩短了转基因棉花的获取周期，提高了转化效率。另外，利用本方法进行转化不受棉花基因型限制，为实现大规模转基因棉花生产、育种提供了可能。附图说明图1为本专利技术实施例1中质粒pZZ00090的结构示意图。图2为本专利技术实施例1中棉花胚尖示意图。图3为本专利技术实施例1中农杆菌介导棉花胚尖转化的流程图；其中，A为棉花种子；B为去绒消毒后的棉花种子；C为浸种后的棉花种子，D为去掉种皮子叶的棉花胚尖；E为棉花胚尖与农杆菌共培养；F为胚尖诱导筛选产生抗性芽；G为抗性芽伸长并生根；H为移入温室的棉花转基因幼苗。图4为本专利技术实施例4中棉花幼苗GFP瞬时表达图；其中，A为Coker312转基因幼苗在白光下的影像；B为Coker312转基因幼苗在荧光下的影像；C为鄂棉24转基因幼苗在白光下的影像；D为鄂棉24转基因幼苗在荧光下的影像。图5为本专利技术实施例4中转基因植株的PCR检测图；其中，M为2kb分子量标准；1-15为转基因棉花编号；-为阴性对照；+为阳性对照。图6为本专利技术实施例4中转基因植株的Southern-blot检测结果；其中，1-4为单个转基因事件，5为WT对照，6为蛋白Marker。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Samb本文档来自技高网...

【技术保护点】
农杆菌介导的棉花胚尖快速转化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将棉花种子去绒灭菌后，浸泡于MSB培养基中，使其吸胀，然后在无菌条件下剥去吸胀的种皮，除去两片子叶，使胚尖裸露，放入含有FM培养基的离心管中，准备侵染；(2)将胚尖浸入携带外源目的基因和标记基因质粒的农杆菌菌液中侵染，辅以超声波处理；(3)将胚尖移至共培养培养基上进行共培养；(4)将胚尖移至恢复培养基上培养；(5)将胚尖移至筛选培养基上培养，诱导抗性芽的形成；(6)抗性芽在生根培养基上生根后炼苗、移栽，得到转基因棉花植株；所述MSB培养基的组成如下：MS基本培养基4.0‑5.2g/L+维生素B5培养基0.8‑1.2mg/L+葡萄糖酸钙1.0‑1.5g/L；其中，维生素B5培养基的组成如下：肌醇100mg/L+盐酸硫胺素10mg/L+盐酸吡哆素1mg/L+烟酸1mg/L；所述FM培养基的组成如下：硫酸镁0.1g/L+硝酸钾1g/L+硫酸铵53.6mg/L+磷酸氢钠52.2mg/L+氯化钙60mg/L+硼酸0.3mg/L+硫酸锰1mg/L+硫酸锌0.2mg/L+碘化钾0.075mg/L+钼酸钠0.025mg/L+氯化钴2.5μg/L+硫酸铜1.6μg/L+Na2·EDTA 2.8mg/L+葡萄糖30g/L+MES 3.9g/L+肌醇10mg/L+烟酸0.1mg/L+维生素B60.1mg/L+维生素B10.1mg/L+乙酰丁香酮292.4mg/L；所述共培养培养基中含有终浓度为0.1‑400mg/L的半胱氨酸；优选含有终浓度为200mg/L的半胱氨酸；所述筛选培养基中含有终浓度分别为1‑2mg/L的6‑苄氨基嘌呤和0.01‑0.1mg/L的萘乙酸；优选含有终浓度分别为1mg/L的6‑苄氨基嘌呤和0.1mg/L的萘乙酸。...

【技术特征摘要】
1.农杆菌介导的棉花胚尖快速转化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将棉花种子去绒灭菌后，浸泡于MSB培养基中，使其吸胀，然后在无菌条件下剥去吸胀的种皮，除去两片子叶，使胚尖裸露，放入含有FM培养基的离心管中，准备侵染；(2)将胚尖浸入携带外源目的基因和标记基因质粒的农杆菌菌液中侵染，辅以超声波处理；(3)将胚尖移至共培养培养基上进行共培养；(4)将胚尖移至恢复培养基上培养；(5)将胚尖移至筛选培养基上培养，诱导抗性芽的形成；(6)抗性芽在生根培养基上生根后炼苗、移栽，得到转基因棉花植株；所述MSB培养基的组成如下：MS基本培养基4.0-5.2g/L+维生素B5培养基0.8-1.2mg/L+葡萄糖酸钙1.0-1.5g/L；其中，维生素B5培养基的组成如下：肌醇100mg/L+盐酸硫胺素10mg/L+盐酸吡哆素1mg/L+烟酸1mg/L；所述FM培养基的组成如下：硫酸镁0.1g/L+硝酸钾1g/L+硫酸铵53.6mg/L+磷酸氢钠52.2mg/L+氯化钙60mg/L+硼酸0.3mg/L+硫酸锰1mg/L+硫酸锌0.2mg/L+碘化钾0.075mg/L+钼酸钠0.025mg/L+氯化钴2.5μg/L+硫酸铜1.6μg/L+Na2·EDTA2.8mg/L+葡萄糖30g/L+MES3.9g/L+肌醇10mg/L+烟酸0.1mg/L+维生素B60.1mg/L+维生素B10.1mg/L+乙酰丁香酮292.4mg/L；所述共培养培养基中含有终浓度为0.1-400mg/L的半胱氨酸；优选含有终浓度为200mg/L的半胱氨酸；所述筛选培养基中含有终浓度分别为1-2mg/L的6-苄氨基嘌呤和0.01-0.1mg/L的萘乙酸；优选含有终浓度分别为1mg/L的6-苄氨基嘌呤和0.1mg/L的萘乙酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中棉花种子去绒灭菌的具体方法为：将棉花种子用95％浓硫酸浸泡脱去表面短绒，然后用清水冲洗，晾干；将种子用75％乙醇浸泡10-15分钟，弃掉乙醇，然后浸泡于20％过氧化氢中，在100rpm摇床上室温震荡1-2小时，最后用无菌水冲洗3...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晓凤，邱龙，陈凯，旷乐，章旺根，成雄鹰，马崇烈，
申请(专利权)人：中国种子集团有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11