具有功能失调的T3SS蛋白的抗菌性转基因植物制造技术

本发明专利技术公开了一种核酸表达载体，所述核酸表达载体包含编码显性负性T3SS蛋白的核酸序列。所述核酸表达载体还包括能够驱动所述核酸序列在植物细胞中转录的顺式作用调控元件。此外，所述显性负性T3SS蛋白介导功能失调的针状复合物的组装。

Transgenic plants with antibacterial properties of dysfunctional T3SS proteins

The present invention discloses a nucleic acid expression vector comprising a nucleic acid sequence encoding a dominant negative T3SS protein. The nucleic acid expression vector also includes a cis acting regulatory element capable of driving transcription of the nucleic acid sequence in plant cells. In addition, the dominant negative T3SS protein mediates the assembly of dysfunctional needle complexes.

【技术实现步骤摘要】
具有功能失调的T3SS蛋白的抗菌性转基因植物本申请是申请号为201280021463.5、申请日为2012年3月1日、专利技术名称为“具有功能失调的T3SS蛋白的抗菌性转基因植物”的中国专利技术专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/IL2012/050069的国家阶段申请，该国际申请要求申请日为2011年3月2日，申请号为61/448,223的美国申请的优先权。
本专利技术，在其些实施方式中，涉及抗菌性植物及制备所述植物的方法。专利技术背景青枯雷尔氏菌(Rs)，是一种分布广泛的革兰氏阴性的土壤传播性病原体，它属于β-亚门的蛋白菌，能导致超过200种植物的致死性萎蔫疾病，这些植物包括重要的经济作物，例如番茄，马铃薯和香蕉。细菌通过伤口进入植物根部，侵入木质部并通过脉管系统迅速蔓延至植物的气生部位。茎上很快可以发现超过1010每厘米的细胞群。Rs的主要毒力因子是表多糖(EPS)，一种长的(超过106Da)糖聚合物。表多糖能堵塞木质部并导致萎蔫症状，并最终导致植物死亡。RS具有突出的蛋白分泌能力，其能分泌超过100种蛋白质。例如，II型分泌系统(T2SS)分泌因子，包括植物细胞壁降解果胶酶，内切葡聚糖酶，以及最近发现的，毒力EPS(图1A-C)。III型分泌系统(T3SS)分泌促感染效应蛋白(T3E)进入宿主细胞，以优化宿主环境，并抑制入侵后的植物防御反应(图1A-C)。III型分泌系统(T3SS)是革兰氏阴性菌的一个复杂的分子机器，其能将细菌蛋白(效应器)“注入”(转移入)真核细胞。为此，T3SS必须组装成一个多蛋白复合物，它由不同的部分组成：跨越两个细菌细胞膜与细胞质茎相连接的基体；连接在基体上的类似于分子注射器(注射体(injectisome)/菌毛)的针状结构；和能够重组成易位子的远端针尖结构。易位子是一种蛋白质复合物结构，其能插入宿主细胞的膜。菌毛仅由一种蛋白亚基组成。多个亚基寡聚成菌毛结构。所述针状结构，使细菌蛋白能通过所述针的内部通道(导管)被输送至宿主细胞(图1A-C)。因此，T3SS的主要胞外成分是从所述装置的外膜部分延伸的针，并且通过该针形成的通道以形成分泌导管(所述针的螺旋参数为每转5.5亚基；每亚基轴向上升)。所述针是由单种小蛋白(9kDa)的多个副本(大约100-150)的螺旋组件形成。虽然大多数革兰氏阴性菌的菌毛结构单元的一级序列之间几乎没有同源性，但据信它们大多数具有某些结构同源性。在植物病原细菌中，T3SS由hrp(过敏性反应和致病性)基因编码，这样命名是因为它们都是细菌在易感植物中引起疾病，并在抗性植物中诱导过敏性反应所必须的。几乎在所有主要的革兰氏阴性细菌植物病原体中(如丁香假单胞菌，黄单胞菌，青枯雷尔氏菌，和欧文氏菌)已发现hrp基因，这也说明T3SS在调节不同的植物与细菌间相互作用中的核心作用。因此，通常情况下，T3SS外菌毛的组装是通过主要组分(例如青枯雷尔氏菌的HrpY，丁香假单胞菌和解淀粉欧文氏菌的HrpA，野油菜黄单胞菌的HrpE，志贺氏菌的MxiH，沙门氏菌的PrgI和耶尔森氏菌的YscF)的逐步聚合而成。如前所述，虽然III型效应器的主要功能是促进植物的易感性，一些效应器被能触发防御反应的植物抗性蛋白所识别，防御反应包括过敏性反应。所提供的一种克服革兰氏阴性菌所导致的植物致死性感染的方法，包括增强植物对此类病原体的免疫力。美国专利申请号20090258825(He等)公开了用于增强植物抵御病原体(如细菌病原体)的组合物和方法。根据其教导，通过增加ATMIN相关的植物保护蛋白，如ATMIN7的活性，可有效增强植物针对丁香假单胞菌毒力蛋白HopM1的免疫力。美国专利申请号20090044296(Beer等)公开了增加植物生长或赋予植物抗病性的方法，所述方法通过使用适于增加或减少核酸分子表达的核酸分子，所述核酸分子编码HrpN相互作用蛋白(例如HIPM)。其中所公开的缺失分析显示了解淀粉欧文氏菌HrpN(Harpin)的198个氨基酸的N-末端区为与HIPM相互作用所必需。这一HrpN的N-末端区为首次发现的无细胞过敏性反应激发剂，其在所述病原体的毒性中起着关键作用。此外，由于其病原体所具有土壤传播的性质，细菌性萎蔫病较难控制。在Rs感染的植物中，疾病的发展取决于II型和III型蛋白质分泌系统的作用，并且这些系统中的一个突变将产生非致病性细菌[Poueymiro等，Curr.Opin.Microbiol.(2009)12:44-52]。Roine等[Roine等，FEBSLetters(1997)417(2):168-172]表明，一旦纯化，HrpA，即丁香假单胞菌蕃茄致病变种(Pseudomonassyringaepv.tomota)DC3000菌毛的结构蛋白，其本身就足以通过自组装形成丝结构。Taira等[Taira等，MolMicrobiol.(1999)34(4):737-44]在HrpA基因处产生插入突变(例如，插入五肽)，并产生相应表达的突变细菌。根据其教导，HrpA的羧基末端区对于菌毛组装以及细菌与受影响的植物间相互作用是至关重要的。此外，Wei等[Wei等，PNAS(2000)97(5):2247-2252]鉴定了在HrpA羧基端影响HrpA蛋白分泌或调节功能的三个单氨基酸突变。这些结果证明了Hrp菌毛结构基因在蛋白分泌和丁香假单胞菌的III型分泌系统的协同调节中的关键作用。此外，Lee等[Lee等,J.Bio.Chem.(2005):21409-17]公开了一些五肽诱导的非功能HrpA蛋白，当其在细菌中表达时，对野生型HrpA蛋白的功能产生强大的显性负性作用，从而阻断丁香假单胞菌诱导宿主反应并导致体内疾病的能力。显性负性HrpA突变体也能干扰野生型HrpA在体外自组装成菌毛。Weber等[Weber和Koebnik,J.Bacteriology(2005)187(17):6175-6186]描述了若干Hrp菌毛蛋白的疏水性绘图分析，所述Hrp菌毛蛋白例如野油菜黄单胞菌疮痂病菌的HrpE和HrpA，以及青枯雷尔氏菌的HrpY，并发现了一个共同的结构域组织。这些结果表明，植物致病细菌，为了克服植物细胞壁的障碍，独立地进化出结构上类似的蛋白。Weber等进一步公开了HrpEC-端区域的五肽插入突变体能抑制Hrp菌毛在野油菜黄单胞菌疮痂病菌中的组装。形态学研究揭示了这些插入突变体具有缩短的Hrp菌毛。此显性负性作用表明，该突变体可能干扰了Hrp菌毛的组装。美国专利申请号20100249234(Yang等)公开了降低细菌毒力的方法，如HrpX/HrpY型系统或T3SS型系统。该方法包括将细菌与有效量的苯丙烷型抑制化合物相接触。美国专利申请号20100099674(Elofsson等)公开了在植物中降低细菌毒力的方法，其通过N-取代的7-喹啉基甲基胺抑制III型分泌系统，特别地，其中一个是喹啉环上5-和8-位进一步被取代。其它
技术介绍
包括美国专利申请号20050076406。专利技术概述本专利技术实施方式的一方面，提供了一种核酸表达载体，所述核酸表达载体包含核酸序列和顺式作用调控元件，所述核酸序列编码显性负性T3SS蛋白，所述顺式作用调控元件能够驱本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸表达载体，所述核酸表达载体包含核酸序列和异源顺式作用调控元件，所述核酸序列编码显性负性III型分泌系统(T3SS)蛋白，所述异源顺式作用调控元件能够驱动所述核酸序列在植物细胞中转录，所述显性负性T3SS蛋白包含至少一个氨基酸插入，其使菌毛发生结构变形并且介导功能失调的针状复合物的组装。

【技术特征摘要】
2011.03.02 US 61/448,2231.一种核酸表达载体，所述核酸表达载体包含核酸序列和异源顺式作用调控元件，所述核酸序列编码显性负性III型分泌系统(T3SS)蛋白，所述异源顺式作用调控元件能够驱动所述核酸序列在植物细胞中转录，所述显性负性T3SS蛋白包含至少一个氨基酸插入，其使菌毛发生结构变形并且介导功能失调的针状复合物的组装。2.根据权利要求1所述的核酸表达载体，还包含附加核酸序列，所述附加核酸序列编码分泌信号肽，所述分泌信号肽在编码所述显性负性T3SS的核酸序列的上游并在所述显性负性T3SS的核酸序列的框内。3.根据权利要求1所述的核酸表达载体，其中所述异源顺式作用调控元件包含启动子序列。4.根据权利要求3所述的核酸表达载体，其中所述启动子序列是组成型启动子。5.根据权利要求4所述的核酸表达载体，其中所述组成型启动子是CaMV35S启动子。6.根据权利要求1所述的核酸表达载体，其中所述T3SS蛋白是T3SS结构蛋白。7.根据权利要求6所述的核酸表达载体，其中所述T3SS结构蛋白是过敏性反应和致病性(HRP)蛋白。8.根据权利要求1所述的核酸表达载体，其中所述T3SS蛋白选自青枯雷尔氏菌HrpY蛋白，丁香假单胞菌HrpA蛋白，解淀粉欧文氏菌HrpA蛋白，野油菜黄单胞菌HrpE蛋白，亚洲梨火欧文氏菌HrpA蛋白和白叶枯黄单胞菌HrpE蛋白。9.根据权利要求1所述的核酸表达载体，其中所述T3SS蛋白是青枯雷尔氏菌易位子蛋白。10.根据权利要求9所述的核酸表达载体，其中所述青枯雷尔氏菌易位子蛋白选自PopF1和PopF2。11.根据权利要求1所述的核酸表达载体，其中所述至少一个氨基酸嵌入包含插入闭锁元件(IBE)。12.根据权利要求11所述的核酸表达载体，其中所述IBE包含3-10个氨基酸，其使菌毛发生结构变形。13.根据权利要求1所述的核酸表达载体，其中所述至少一个氨基酸插入包含β阻断氨基酸。14.根据权利要求13所述的核酸表达载体，其中所述β阻断氨基酸包含脯氨酸的插入。15.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：哈南·施泰因，德罗尔·阿维萨尔，
申请(专利权)人：富途锐基尼以色列有限公司，
类型：发明
国别省市：以色列,IL