The invention provides a method for achieving transient gene expression in peach fruit, the expression in pulp tissue gene by vacuum infiltration mode of infection, can be used for gene function research. By the way: 1) peach fruit maturity; 2) competent pre infected peach flesh tissue culture; 3) will be immersed in the flesh containing gene of Agrobacterium infection solution; 4) applying a vacuum to pulp tissue; 5) release 6) gene into vacuum implementation; pulp tissue infection after training continue to. Gene transient expression established by the invention method, suitable for thin peel, pulp cavity free peach fruit, simple operation, high expression level and reliable results, can provide technical support for the development of gene function and gene screening.
【技术实现步骤摘要】
一种在桃果实中实现基因瞬时表达的方法
本专利技术属于植物分子生物技术和基因工程领域,涉及一种将目标基因在桃果实实现瞬时表达的方法。
技术介绍
随着越来越多植物基因组测序的完成,以及转录组测序技术的发展,功能基因的挖掘正在成为植物生物学研究的重要内容。转基因技术是开展目标基因功能研究的主要手段。但是对于大多数植物,尤其是多年生果树而言,除了苹果、柑橘和葡萄等,大多数果树尚未建立稳定的转基因技术。转基因技术的缺乏已经成为果树功能基因挖掘的限制因子,也是影响果树分子生物学发展的瓶颈因素。相对于转基因技术的稳定表达特征,近年来发展了基于瞬时表达的功能基因筛选方法。随着目前国际上日趋强调的基于同源物种的基因功能验证,瞬时表达技术正得到越来越多的关注。瞬时表达(transientexpression)是指将目标基因通过特定的植物表达载体导入到植物活体内,在短时间内(可长达数天)表达,能够准确反应基因的功能,在启动子分析、蛋白互作和基因功能分析等方面用途广泛。瞬时表达的转化方法主要有农杆菌转化法、基因枪轰击法以及原生质体转化法几种。原生质体转化方法对材料有很大限制,目前主要在拟南芥叶片与玉米原生质体及水稻悬浮细胞中实施。基因枪轰击法对设备的要求较高,且每次得到的植物组织质量少,难以满足后续有关的生物学表型分析。农杆菌转化法具有简单快速、表达水平高和安全有效等特点。基于农杆菌转化技术的瞬时表达方法,虽然近几年得到了不断完善和发展,但是在果实上的成功应用依然有限。目前仅限于有腔室的番茄,以及果皮肥厚的柑橘。上述两种果实的瞬时表达方法都是采用注射器直接注射农杆菌到果实组织实现 ...
【技术保护点】
一种在桃果实中实现基因瞬时表达的方法,其特征在于,通过以下方法实现目标基因转入桃果肉组织并瞬时过量表达:(1)桃果实成熟度的选择;(2)桃果肉组织切片的制作及预侵染的感受态培养;(3)将(2)中得到的易感状态的果肉切片浸没于包含农杆菌和表面活性剂的侵染溶液中,这些农杆菌细胞中含有目标基因的核苷酸序列SEQ:NO.1;(4)把目标基因转入果肉组织,向(3)中的溶液中施加压强为‑70Kpa的真空环境;(5)缓慢释放真空,使包含有目标基因的农杆菌细胞进入果肉;(6)果肉组织侵染后的再培养,实现目标基因的瞬时过量表达。
【技术特征摘要】
1.一种在桃果实中实现基因瞬时表达的方法,其特征在于,通过以下方法实现目标基因转入桃果肉组织并瞬时过量表达:(1)桃果实成熟度的选择;(2)桃果肉组织切片的制作及预侵染的感受态培养;(3)将(2)中得到的易感状态的果肉切片浸没于包含农杆菌和表面活性剂的侵染溶液中,这些农杆菌细胞中含有目标基因的核苷酸序列SEQ:NO.1;(4)把目标基因转入果肉组织,向(3)中的溶液中施加压强为-70Kpa的真空环境;(5)缓慢释放真空,使包含有目标基因的农杆菌细胞进入果肉;(6)果肉组织侵染后的再培养,实现目标基因的瞬时过量表达。2.根据权利要求1所述的一种在桃果实中实现基因瞬时表达的方法,其特征在于,步骤(1)选取成熟度的桃果实,以选择在绿熟期到商业采收期之间的成熟度果实,即选择桃果实发育过程中的第一次快速膨大期结束到第二次快速膨大期结束期间的成熟度果实。3.根据权利要求1所述的一种在桃果实中实现基因瞬时表达的方法,其特征在于,步骤(2)桃果肉组织切片的制作与预侵染的感受态培养,通过以下步骤实现:(a)果实的消毒处理:选择果型正常,无机械伤和病虫害的果实进行后续实验,果实洗净去除表面污物,然后用50%的乙醇溶液消毒1min,再用有效氯含量在75-100mg·L-1的次氯酸钠水溶液浸泡20min消毒,最后用无菌水漂洗3-5次,在无菌状态下晾干待用;(b)果实切片的制作与预培养:选取距果实缝合线90°垂直的2个表面,成熟度较为一致的赤道面选取果肉部位,去除果皮后,将果肉组织切成为厚度为1cm,面积大约为4-8cm2的小块,将制备好的果肉切片放置在MS固体培养基上,黑暗条件下预培养24-30h,预培养的条件是23℃,80-85%相对湿度。4.根据权利要求1所述的一种在桃果实中实现基因瞬时表达的方法,其特征在于,步骤(3)...
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