一种提高紫花苜蓿遗传转化效率的方法技术

本发明专利技术公开的一种提高紫花苜蓿遗传转化效率的方法，包括如下步骤，(1)播种、培养紫花苜蓿；(2)配置菌液：挑取含有Medtr4g107010.1基因的农杆菌单菌落，将菌落置于YEP培养基过夜培养，离心收集菌液沉淀，用MS液体培养基将收集到的农杆菌菌液悬浮至OD

Method for improving genetic transformation efficiency of Alfalfa

A method to improve the conversion efficiency of alfalfa genetic method disclosed by the invention comprises the following steps of: (1) sowing, cultivation of alfalfa; (2) configuration: single bacteria Agrobacterium colonies containing Medtr4g107010.1 gene, the colonies on the YEP medium and cultured overnight, is collected by MS liquid liquid precipitation. The medium will be collected from the bacterial suspension to OD

【技术实现步骤摘要】
一种提高紫花苜蓿遗传转化效率的方法
本专利技术属于基因工程利用
，具体为一种提高紫花苜蓿遗传转化效率的方法。
技术介绍
紫花苜蓿是世界上广泛种植的一种多年生优质豆科牧草，其蛋白质含量高，具有较高的饲用价值，有“牧草之王”的美誉。目前常规育种是紫花苜蓿育种的主要途径，为我国紫花苜蓿育种做出了巨大贡献。但是，相对于许多农作物而言，紫花苜蓿遗传背景复杂，杂合度高，许多性状的遗传机理不明，性状分析非常困难。而转基因技术可将优良基因导入紫花苜蓿，定向改良紫花苜蓿的抗除草剂、抗旱、耐盐碱等性状，极大地缩短紫花苜蓿的育种周期。多年来许多研究者致力于根癌农杆菌介导法进行紫花苜蓿遗传转化的研究，取得了显著成绩。但受再生频率低、农杆菌感染后外植体不易分化等因素的影响，紫花苜蓿遗传转化的频率一直较低，难以满足基因工程技术迅速发展的需要。因此，亟待进一步优化紫花苜蓿遗传转化体系，对基因工程技术在紫花苜蓿遗传育种中的广泛应用具有重要的理论和实践意义。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种提高紫花苜蓿遗传转化效率的方法，实现能够快速、高效获得转基因紫花苜蓿的目的，使其遗传转化效率提升至9.38％，对基因工程技术在紫花苜蓿遗传育种中的广泛应用具有重要的理论和实践意义。为了实现上述目的，本专利技术公开的技术方案为：本专利技术公开的提高紫花苜蓿遗传转化效率的方法，包括如下步骤，(1)播种、培养紫花苜蓿；(2)配置菌液：挑取含有Medtr4g107010.1基因的农杆菌单菌落，Medtr4g107010.1基因的序列如SEQENCE1所示，将菌落置于YEP培养基过夜培养，当OD600值达到0.6-0.9时，离心收集菌液沉淀，用MS液体培养基将收集到的农杆菌菌液悬浮至OD600达0.8-0.9；(3)遗传转化：经步骤(1)培养的紫花苜蓿长出叶片，切取紫花苜蓿无菌苗的叶片，置于MS培养基中，于组培室中培养2d；然后将外植体在步骤(2)得到的菌液悬浮液中侵染，再将外植体转移至MS培养基中，暗培养3d；最后转入含有抗生素的选择培养基中，置于组培室中培养，所述选择培养基以MS培养基为基础，在MS培养基中添加卡那霉素、抗生素、苄氨基腺嘌呤、吲哚丁酸、蔗糖、琼脂。采用本专利技术方法进行花苜蓿遗传转化，快速、高效、遗传转化率高，可提升至9.38％。优选的，所述步骤(2)中YEP培养基的成分包括利福平、卡那霉素、酵母粉、蛋白胨、氯化钠，各成份在YEP培养基中的质量分别为，利福平10-30mg/L，卡那霉素150-200mg/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。该组成的YEP培养基更适合于农杆菌的生长和繁殖。进一步的，所述步骤(2)中过夜培养的方法为，在温度25℃、280rmp的摇床上过夜培养，在该条件下，农杆菌的活性最高，收集菌液沉淀的方法为，于5000rmp、4℃离心10min收集得到。在该条件下，离心时农杆菌不易失去活性而死亡，进一步的，所述步骤(3)中切取的紫花苜蓿无菌苗叶片苗龄为20d，20d苗龄的叶片再生能力最强。进一步的，所述步骤(3)中切取紫花苜蓿无菌苗的叶片，置于MS培养基中，于组培室中培养2d，组培室中光照强度为2000lx、温度为24-26℃、光周期为早/晚给予光照16h/8h的光照。在该条件下，有利用叶片外植体恢复活性。进一步的，所述步骤(3)中然后将外植体在步骤(2)得到的菌液悬浮液中侵染的时间为8min。侵染时间过短，农杆菌不易整合进外植体，侵染时间过长，农杆菌浓度多大，外植体易死亡。进一步的，所述步骤(3)中选择培养基中各成份在培养基中的质量为，所述步骤(3)中选择培养基中MS培养基为1L，各成份在MS培养基中的质量为卡那霉素10mg/L、抗生素250mg/L、苄氨基腺嘌呤1mg/L、吲哚丁酸0.05mg/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L。在该条件下，有利用控制农杆菌的污染以及有利用外源基因整合进外植体。进一步的，所述步骤(3)中将外植体转入含有抗生素的选择培养基中，置于组培室中培养，培养室中光照强度为2000lx、温度为24-26℃、光周期为早/晚给予16h/8h的光照。在该条件下，有利用外植体的生长以及外源基因的整合。进一步的，所述步骤(3)中选择培养基中的抗生素为哌拉西林，在选择培养时必须使用抗生素杀死外植体表面的农杆菌，否则由于农杆菌的过度繁殖造成外植体被侵染处转化细胞的死亡，严重影响植物的遗传转化。良好的抗生素应具有既可以抑制农杆菌的生长又不能影响芽的再生的特点，植物遗传转化中通常使用的抗生素有羧苄青霉素、头孢霉素和氨苄青霉素等，其中羧苄青霉素的抑菌效果要优于其他几种，但该抗生素低浓度时很难抑制外植体表面农杆菌的繁殖，但浓度过高时，芽的再生受到严重抑制。本专利技术首次在紫花苜蓿遗传转化中使用了抗生素哌拉西林，该抗生素在紫花苜蓿的遗传转化中从未见报道。实验结果显示哌拉西林抑制农杆菌的效果要明显优于羧苄青霉素，当选择培养基中哌拉西林浓度为250mg/L时，能较好地控制农杆菌污染，且结合我们优化的紫花苜蓿遗传转化体系，使得紫花苜蓿的转化效率达到9.38％，较一般转化效率提高4％左右。进一步的，所述花苜蓿基因型为保定苜蓿，保定苜蓿丰产性好、产量品质优，抗病虫能力强。本专利技术所采用的MS培养基包括大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、以及蔗糖、琼脂，大量元素包括在MS培养基中浓度为1900mg/L的硝酸钾、1650mg/L的硝酸铵、170mg/L的磷酸二氢钾、370mg/L的硫酸镁、440mg/L的氯化钙；微量元素包括在MS培养基中浓度为0.83mg/L的氯化钾、6.2mg/L的硼酸、22.3mg/L的硫酸锰、8.6mg/L的硫酸锌、0.25mg/L的钼酸钠、0.025mg/L的硫酸铜、0.025mg/L的氯化钴；铁盐包括在MS培养基中浓度为37.3mg/L的乙二胺四乙酸二钠、27.8mg/L的硫酸亚铁；有机成分包括在MS培养基中浓度为100mg/L的肌醇、2mg/L的甘氨酸、0.1mg/L的盐酸硫胺素VB1、0.5mg/L的盐酸吡哆醇VB6、0.5mg/L的烟酸VB5；蔗糖在MS培养基中浓度为30g/L，琼脂在MS培养基中浓度为7g/L。本专利技术的积极进步效果在于：按照本专利技术方法培养得到转基因紫花苜蓿，显著促进不定芽的再生，能够快速、高效获得转基因植株，提高转化效率。附图说明图1：选择培养基中卡那霉素抗性植株的获得；图2：转Medtr4g107010.1基因植株的PCR检测，其中1：2kbmarker；2：阳性对照；3：负对照；4-13：转化植株；图3转基因紫花苜蓿的Southernblot检测，其中1：质粒；2：负对照植株；3-5：转化植株。具体实施方式下面通过具体的实施例对本专利技术做进一步的详细描述。实施例一：本专利技术公开的一种提高紫花苜蓿遗传转化效率的方法，包括如下步骤，(1)播种、培养紫花苜蓿：采用现有技术即可，例如将紫花苜蓿种子在75％的乙醇中灭菌1min，然后在14％的次氯酸钠溶液中灭菌12min，无菌水冲洗5次，接种到MS培养基中，置于光照强度为2000lx、(25±1)℃和16h/8h光周期的组培室中培养；(2)配置菌液：挑取含有Medtr4g107010.1基因的农杆菌单菌落，Medtr本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高紫花苜蓿遗传转化效率的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤，(1)播种、培养紫花苜蓿；(2)配置菌液：挑取含有Medtr4g107010.1基因的农杆菌单菌落，Medtr4g107010.1基因的序列如SEQENCE1所示，将菌落置于YEP培养基过夜培养，当OD

【技术特征摘要】
1.一种提高紫花苜蓿遗传转化效率的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤，(1)播种、培养紫花苜蓿；(2)配置菌液：挑取含有Medtr4g107010.1基因的农杆菌单菌落，Medtr4g107010.1基因的序列如SEQENCE1所示，将菌落置于YEP培养基过夜培养，当OD600值达到0.6-0.9时，离心收集菌液沉淀，用MS液体培养基将收集到的农杆菌菌液悬浮至OD600达0.8-0.9；(3)遗传转化：经步骤(1)培养的紫花苜蓿长出叶片，切取紫花苜蓿无菌苗的叶片，置于MS培养基中，于组培室中培养2d；然后将外植体在步骤(2)得到的菌液悬浮液中侵染，再将外植体转移至MS培养基中，暗培养3d；最后转入含有抗生素的选择培养基中，置于组培室中培养，所述选择培养基以MS培养基为基础，在MS培养基中添加卡那霉素、抗生素、苄氨基腺嘌呤、吲哚丁酸、蔗糖、琼脂。2.根据权利要求1所述的提高紫花苜蓿遗传转化效率的方法，其特征在于，所述步骤(2)中YEP培养基的成分包括利福平、卡那霉素、酵母粉、蛋白胨、氯化钠，各成份在YEP培养基中的质量分别为，利福平10-30mg/L，卡那霉素150-200mg/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。3.根据权利要求1所述的提高紫花苜蓿遗传转化效率的方法，其特征在于，所述步骤(2)中过夜培养的方法为，在温度25℃、280rmp的摇床上过夜培养，收集菌液沉淀的方法为，于5000rmp、4℃离心10min收集得到。4.根据权利要求1所述的提高紫花苜蓿遗传转化效率的方法，其特征在于，所述步骤(3)中切取的紫花苜蓿无菌苗叶片苗龄为20d。5.根据权利要求1所述的提高紫花苜蓿遗传转化效率的方法，其特征在于，所述步骤(3)中切取紫花苜蓿无菌苗的叶片，置于MS培养基中，于组培室中培养2d，组培室中光照强度为2000lx、温度为24-26℃、光周期为早/晚给予光照16h/8h的光照。6.根据权利要求1所述的提高紫花苜蓿...

【专利技术属性】
技术研发人员：仪登霞，李聪，郑兴卫，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11