本发明专利技术公开一种预测桃果实香气物质含量的PCR引物及方法，包括两对引物，第一对引物为：上游引物：5’-AGTGGTTGAATCTATAATCCGA-3’；下游引物：5’-TTCAACTCCTTTGTCAAGCC-3’；第二对引物为：上游引物：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTTGCTGCTCTTTAGTCTTCTATGTT-3’；下游引物：5’-ACATTCTTCAATGGCATCCTGT-3’。该方法包括：提取桃组织的基因组DNA；以基因组DNA为模板，分别利用两对引物，进行PCR扩增；对扩增产物进行分析，获得PpACX1和PTS1基因的基因型，预测受检测品种桃果实香气物质含量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，尤其涉及一种预测桃果实香气物质含量的PCR引物及方法。
技术介绍
桃是蔷薇科李属植物,原产我国西部，因其适应性强、栽培范围广、童期短、口感好，深受育种者及广大消费者喜爱。近10年来，世界桃果实生产一直呈上升趋势，2010年生产量达到20，274，287吨，其中中国占52.8% (FA0STAT 2012，http://faostat.fa0.0rg/)。随着新品种不断引入果品市场,及国际市场对果实鲜食品质和加工品质的要求，香气作为品质评价的一顶重要指标，越来越受到人们的关注。香气是评价果实内在品质的关键因子之一。桃果实香气是多基因控制的复杂性状，不同桃品种香气成分及含量差异很大。在桃果实中检测到了 110多种挥发性物质，这些挥发性物质的合成途径主要包括:(I)脂肪酸合成代谢中的:1)脂氧合酶途径；该途径主要合成清香型物质，包括C6醛类、醇类；2) β-氧化途径；该途径主要合成桃特征香气中的内酯类物质,包括占香气组分95%以上的γ，δ-十内酯；酰基辅酶A氧化酶(ACX)参与β-氧化途径的第一步反应，为限速酶。席万鹏等已经从两种桃果肉(白肉桃‘湖景蜜露’和黄肉桃‘锦绣黄桃’)中克隆得到4个ACX基因(PpACXl-4)，发现桃果实在20°C和贮藏过程中PpACXl表达量和ACX酶活性都会增加，内酯含量的变化则与前两者的变化呈正相关。齐玉洁等根据国际桃基因组序列信息(WWW.phytozome.0rg/peach)克隆得到5个ACX编码基因(PpACXl_5),并进行果肉组织特异性表达，发现五个基因成员中，PpACXl在所研究材料的根、茎、叶、果肉中表达最多，为最关键的基因成员。(2)萜类合成途径；花香型成分芳樟醇主要由该途径中的单萜合成酶(PTS)催化栊牛儿酰栊牛儿基二磷酸(GDP)而合成。在拟南芥基因组中发现有20个萜类合成酶基因在花中表达，Atlg61680基因编码蛋白对合成(S)-芳樟醇具有催化作用；从薰衣草中克隆得到的I个芳樟醇合成酶基因(LaLINS)可以大量催化合成香气成分(R)-(-)_芳樟醇。对桃香气候选基因的研究中，通过区段定位方法，将4个萜类合成酶基因(STC、STS、TSU TC)分别定位在李属植物(参照图谱(TXE))的第一和第四连锁群上，但是否影响芳樟醇的合成并不清楚。
技术实现思路
本专利技术提供了一种预测桃果实香气物质含量的PCR引物，利用该PCR引物可以对桃PpACXl基因、PTSl基因的基因型进行检测，并预测桃果实中香气物质的含量。一种预测桃果实香气物质含量的PCR引物， 包括两对引物，第一对引物为:上游引物:5’-AGTGGTTGAATCTATAATCCGA-3’ ；下游引物:5’-TTCAACTCCTTTGTCAAGCC-3’ ；第二对引物为:上游引物:5’-TGTAAAACGACGGCCAGTTGCTGCTCTTTAGTCTTCTATGTT-3，；下游引物:5’-ACATTCTTCAATGGCATCCTGT-3’。对与桃香气组分芳樟醇合成相关的核酸序列进行分析发现，PTSl (GenBank登录号:DY639772)内含子中含有一个以(AT)为重复的SSR片段，该SSR片段及其两侧保守片段的序列如SEQ ID N0.1所示。根据该SSR片段两端的序列设计了上述的第一对引物(PTSl-SSR)，并在PTSl-SSR上游引物的5’端加上绿色荧光基团。对ACX合成基因PpACXl (桃基因组序列ppa002510m)全长进行分析发现，该基因中存在一段以(CT)为重复的SSR片段。该SSR片段及其两侧保守片段的序列如SEQ IDN0.2所示。根据该SSR片段两端的序列设计了上述的第二对引物(ACXl)，该引物的上游序列5’端含有一个通用引物尾巴(M13(-21)-TGTAAAACGACGGCCAGT)，如此可利用通用引物在PCR过程中直接将荧光基团加到产物上。由于SSR片段中串联重复数目不同，且片段两端的序列高度保守，因此，利用特异设计的引物可扩增出不同长度的PCR产物，扩增产物的片段大小即决定了样品的基因型。本专利技术还提供了一种预测桃果实香气物质含量的方法，包括:(1)提取桃组织的基因组DNA ；优选采用CTAB法提取基因组DNA ;并且由于植物的次生代谢物对核酸提取有干扰作用，但幼嫩的新生组织次生代谢物较少、DNA含量高、易于破碎，所述幼嫩的新生组织可以选用幼嫩叶片。(2)以所述基因组DNA为模板，分别利用所述PCR引物进行PCR扩增；其中，采用引物PTSl-SSR进行PCR的反应体系优选为10 μ L，包括:10 X PCRbuffer (Mg2+) 2 μ L, 2mM dNTP 1 μ L, 5U rTaq DNApolymerase 0.1 μ L,正向引物 0.25 μ L,反向引物0.25 μ L,20ng/ μ L DNA模板1 μ L,去离子水4.5 μ L ;反应程序优选为:94°C预变性5min ;94°C变性30s，53°C退火40s，72°C延伸40s，35个循环；最后72°C延伸IOmin ；采用引物ACXl进行PCR的反应体系优选为20 μ L，包括:10 X PCRbuffer (Mg2+) 2 μ L, 2mM dNTP 0.2μ L,5U rTaq DNApolymerase 0.lyL，正向引物0.1 μ L，反向引物0.5 μ L，M13 (-21)荧光通用尾巴0.4 μ L，20ng/ μ LDNA模板2 μ L，去离子水 14.7 μ L ;反应程序优选为:94°C预变性5min ;94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，30个循环；94°C变性30s, 53°C退火30s, 72°C延伸30s, 10个循环；最后72°C延伸IOmin ；其中，第一轮PCR反应主要进行DNA片段的PCR扩增，第二轮PCR则是在已经扩增得到的PCR产物末端增加M13 (-21)荧光通用尾巴；(3)对扩增产物进行分析，获得PpACXl基因和PTSl基因的基因型，预测受检测品种桃果实香气物质含量；所述桃果实香气物质为十内酯和芳樟醇。首先利用群体遗传学分析方法对桃品种香气物质含量的表现型和基因型进行关联性分析；以获得的关联性分析结果为依据，对待测样品的PCR扩增产物进行分析，记录以片段大小为标准的基因型，预测受检测桃品种的果实中十内酯和芳樟醇的含量。若PpACXI基因的基因型为209/213或213/213，则与其他基因型相比，该基因型的桃果实中十内酯的含量较高；若PTSl基因的基因型为183/187，则与其他基因型相比，该基因型的桃果实中芳樟醇的含量较高。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为:(1)利用本专利技术的引物可准确高效地鉴定桃品种的香气物质含量基因型，预测桃果实香气物质含量，进而对桃香气品质进行初步鉴定；(2)利用本专利技术的引物可在苗期对桃叶片进行检测，大大提高了高香气品质桃品种的筛选效率，加快了桃果实香气育种的进程，缩短了育种周期。附图说明图1为PpACXl基因型和表现型关联性分析结果图；图2为PTSl基因型和表现型关联性分析结果图。具体实施例方式I基因组DNA的提取用CTAB法分别提取345个本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种预测桃果实香气物质含量的PCR引物，其特征在于，包括两对引物，第一对引物为：上游引物：5’‑AGTGGTTGAATCTATAATCCGA‑3’；下游引物：5’‑TTCAACTCCTTTGTCAAGCC‑3’；第二对引物为：上游引物：5’‑TGTAAAACGACGGCCAGTTGCTGCTCTTTAGTCTTCTATGTT‑3’；下游引物：5’‑ACATTCTTCAATGGCATCCTGT‑3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高中山，李雄伟，贾惠娟，孟宪桥，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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