一种基因组多拷贝基因拷贝数的快速批量测定方法技术

本发明专利技术公开了一种基因组多拷贝基因拷贝数的快速批量测定方法，一种利用PCR技术对基因组多拷贝基因拷贝数的快速批量测定方法，本方法通过对同一组织DNA样本分别实施某些多拷贝基因和某已知单拷贝基因的PCR扩增并纯化产物，测定各基因PCR纯化产物的质量浓度后根据其核酸序列，将质量浓度换算成摩尔浓度，再分别以梯度稀释后的PCR产物以及组织DNA样本为模板通过同一RT-PCR反应制作这些基因的标准曲线同时获得各基因在DNA样品中的浓度，由于在同一抽提效率下，多拷贝基因的拷贝数就是在相同体积下多拷贝基因的数量除以单拷贝基因的数量，由此可以利用一次96孔RT-PCR反应测定同一生物个体中7个不同多拷贝基因的拷贝数；也可以利用一次384孔RT-PCR反应测定11个不同多拷贝基因的拷贝数，实现快速批量的测定效率。

【技术实现步骤摘要】

:本专利技术涉及一种基因测定方法，尤其涉及一种利用PCR技术和RT-PCR技术对基因组多拷贝基因拷贝数的快速批量测定方法。
技术介绍
:拷贝数目变异(copy-number variant, CNV)也称拷贝数目多态(copy-numberpolymorphism, CNP),是一种大小介于Ikb至3Mb的DNA片段的变异，在人类基因组中广泛分布，其覆盖的核苷酸总数大大超过单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphisms, SNPs)的总数,极大地丰富了基因组遗传变异的多样性，CNV对于物种特异的基因组构成、物种的演化和系统发育以及基因组某些特定区域基因的表达和调控可能具有非常重要的生物学意义，已有研究发现，CNV发生的频率远远高于染色体结构变异，而且在整个基因组中覆盖的核苷酸总数大大超过SNP的总数，由此，研究者们认为，CNV可能和表型变异紧密关联，同时在物种的演化和发展中发挥着重要作用，同时，研究者们还认为此类变异是基因组中最主要的变异，是导致个体间表型差异及各种遗传性疾病和疾病易感性的主要原因，如自闭症(autism),精神分裂症(schizophrenia)和克罗恩病(Crohn' sdisease)的致病机理就是因为正常的多拷贝基因拷贝数突然改变，导致疾病的发生，所以对生物体多拷贝基因拷贝数的快速、准确测定可以对人类某些疾病的诊断和治疗提供生物学方法以及对生命科学中相关现象的生理机制研究提供科学手段。现行测定基因拷贝数的方法主要有:1、基因组测序法:是通过多种测序方法对整个基因组的所有基因序列进行测定，将得到的序列与目的基因序列进行比对分析，从而得到目的基因的拷贝数；2、基因芯片技术:就是通过微阵列技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的基因探针有规律地排列固定于2cm2的硅片、玻片等支持物上，构成一个二维DNA探针阵列，当溶液中带有荧光标记的核酸序列与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列，据此可重组出目标基因的拷贝数；3、DNA复性动力学法:是指DNA经热变性，再恢复(重新复性)过程的动力学分析，按DNA复性速度的快慢，将真核生物的DNA分为单一顺序、中度重复顺序和高度重复顺序三类不同的基因组织，从而得到目的基因的拷贝数；4、生物杂交法:将转基因动植物个体和非转基因动植物个体相互杂交，根据子代中转基因动植物个体的数量和孟德尔定律，推算出目标基因在转基因动植物个体中的拷贝数；5、Southern印迹法:将转基因个体的DNA用限制性内切酶水解，然后用琼脂糖凝胶电泳将DNA按片段大小分开，再将其转移到硝酸纤维或尼龙膜上 ，将目标基因用放射性同位素或其他方法标记，然后和印到膜上的DNA杂交，根据放射性条带的数值，推断出目标基因的拷贝数；6、荧光定量法:实时PCR又称TapMan PCR,它用一对基因的PCR引物和探针以及DNA聚合酶，通过反复的热冷循环，使目标基因以指数形式扩增，由于PCR产物可以用荧光信号来定量，而且荧光阈值循环数(Ct)与被扩增基因的起始浓度对数是直线负相关的，因此可以用目标基因和已知内参基因来确定目标基因的拷贝数。现有技术的主要缺陷在于:1、用时长、耗费大，上述测序法和芯片法费用高、花费时间长，特别是芯片的设计和定制需要较高的费用和时间；同时，数据的处理繁琐，生物杂交法需要一个完整的生长周期才能产生子一代，并需要检测大量的子一代才可以获得有统计意义的数据；2、需特殊设备和装置，如上述Southern印迹法需要放射性同位素操作和暗室等基础设施和条件，还需要大量的资金处理放射性废弃物，非放射性方法很难达到检测单一基因的灵敏度，且价格昂贵；3.测定数据不够精确，对DNA复性动力学法，因为在实验操作中影响DNA动力学的因素很多，比如温度、电解质环境等，对结果的准确度有一定影响；4、基于不充分假设，上述实时PCR法基于一个不充分的假设，即目标基因和内参基因具有同样的扩增系数，但这个假设一般难以成立，不同序列和长度的基因，其PCR扩增系数有差异，由于PCR是以指数方式扩增基因的，微小的PCR扩增系数差异会在多个循环扩增后被成倍放大，造成PCR扩增的巨大差异，直接影响基因拷贝数的计算，现有通过实时PCR快速测定基因拷贝数的方法是基于TapMan荧光探针实现，这种定量的方法需要花费较长时间来完成对探针的设计和定制，同时对于某些基因难以设计出理想的TapMan荧光探针，相对于普通荧光定量PCR费用较高，同时现有的实时定量测定基因拷贝数的方法需要将目的基因和单拷贝内参基因进行不同比例的混合稀释，而对于小体积液体的反复混合和稀释处理,必将大大增加实验误差
技术实现思路
:本专利技术的目的在研制一种解决上述问题，提供花费时间短，耗费成本低，易操作的一种利用PCR技术和RT-PCR技术对基 因组多拷贝基因拷贝数的快速批量测定方法。本专利技术通过以下技术方案实现:本专利技术利用实时PCR对基因组多拷贝基因拷贝数的测定方法主要是通过TapMan探针定量的方法对目的基因和单拷贝的内参基因进行不同比例混合后定量测定，这种利用TapMan探针定量的方法费用较高，操作繁琐，对引物和探针的设计要求较高，同时对目的基因和单拷贝内参基因的反复混合和混合后稀释处理将加大实验误差，降低测定结果的准确度，本方法通过PCR技术结合普通荧光定量，分别对目的基因(多拷贝基因)和内参基因(已知单拷贝基因)进行梯度稀释后制作标准曲线，不需将目的基因和内参基因进行混合处理，同时可以在96孔荧光定量PCR反应中应用温度梯度程序设计各自引物的退火温度，实现一次定量测定7个多拷贝基因的快速批量测定:第一步，抽提待测生物个体DNA样品，对需测定的多拷贝基因(XpX2、X3……Xn)和作为内参已知单拷贝基因⑴进行PCR扩增引物设计；第二步，以个体DNA样品为模板对各基因(XpX2、X3……Xn、Y)进行PCR扩增，并对PCR产物纯化；第三步，测定各基因的PCR纯化产物的质量浓度，并根据其核酸序列，将质量浓度换算成摩尔浓度，分别为Mp M2、M3......Mn、My ;第四步，分别对各基因的PCR纯化产物进行梯度稀释；第五步，分别以梯度稀释后各基因的PCR纯化产物和组织DNA样本作为模板，通过同一 RT-PCR反应制作这些基因的标准曲线，同时获得在组织DNA样品中各基因的含量(Ct值)；第六步，通过各个基因的标准曲线和组织DNA样品中各基因的表达量，计算出各基因的摩尔浓度……mn、mY，；第七步，根据在同一组织DNA样品中多拷贝基因的数量是单拷贝基因的拷贝数的倍数关系，通过一套方程组联解得到所测基因在基因组中的拷贝数，达到专利技术目的。附图说明:下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。图1为本专利技术PCR对基因组多拷贝基因拷贝数的快速批量测定方法流程解示意图。图2为本专利技术PT-PCR排版设计利用荧光定量仪的温度梯度程序示意图。图3为本专利技术Xn基因多拷贝基因摩尔浓度-Ct值标准曲线示意图。图4为本专利技术Y基因单拷贝基因的摩尔浓度-Ct值标准曲线示意图。具体实施方式:如图1-4所示，本专利技术具体的实施方法如下:图1-4所示的本专利技术的组织DNA样品可通过任何试剂盒提取本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因组多拷贝基因拷贝数的快速批量测定方法，利用PCR技术对基因组多拷贝基因的拷贝数的快速批量测定方法，第一步，抽提待测生物个体DNA样品，对需测定的多拷贝基因(X1、X2、X3……Xn)和作为内参已知单拷贝基因(Y)进行PCR扩增引物设计；第二步，以个体DNA样品为模板对各基因(X1、X2、X3……Xn、Y)进行PCR扩增，并对PCR产物纯化；第三步，测定各基因的PCR纯化产物的质量浓度，并根据其核酸序列，将质量浓度换算成摩尔浓度，分别为M1、M2、M3......Mn、MY；第四步，分别对各基因的PCR纯化产物进行梯度稀释；第五步，分别以梯度稀释后各基因的PCR纯化产物和组织DNA样本作为模板，通过同一RT‑PCR反应制作这些基因的标准曲线，同时获得在组织DNA样品中各基因的含量(Ct值)；第六步，通过各个基因的标准曲线和组织DNA样品中各基因的表达量，计算出各基因的摩尔浓度m1、m2、m3……mn、mY，；第七步，根据在同一组织DNA样品中多拷贝基因的数量是单拷贝基因的拷贝数的倍数关系，通过一套方程组联解得到所测基因在基因组中的拷贝数。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：沈林園，朱砺，李雪梅，沈静，张顺华，李学伟，李学杰，高菲，蒋小兵，郑梦月，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51