本发明专利技术涉及检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性试剂盒及制备方法。本发明专利技术试剂盒由提取粪便DNA试剂，PCR反应试剂，PCR产物纯化试剂和纯化产物酶切试剂组成；制备DNA提取试剂，制备PCR反应试剂。本发明专利技术克服了过去E-test法操作复杂，且稳定性差，易受外界条件干扰；胃粘膜提DNA法同样存在操作复杂，病人痛苦不愿配合等缺陷。本发明专利技术将易获取的宏观物质转化至分子水平进行研究.且将细菌DNA的提取、扩增、纯化、酶切等步骤融合成整体完成，不仅能取得可靠的幽门螺杆菌对克拉霉素耐药结果，并且在检测标本获取上具备操作简便、费用低，病人痛苦小、依从性高等特点，同时检测流程规范、便捷，能够实现广泛应用于临床的幽门螺杆菌耐药性检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及耐药检测方法，特别涉及。
技术介绍
目前，我国幽门螺杆菌感染率超过50%，部分高发地区甚至到达70%-80 %。幽门螺杆菌被认为是I类致癌因子，长期幽门螺杆菌感染会导致萎缩性胃炎，肠化生甚至胃癌。随着幽门螺杆菌对抗生素耐药性增加，根除率降低，尤其以常用抗生素克拉霉素为著，因此检测其对克拉霉素的耐药情况尤为重要。在本专利技术之前，检测幽门螺杆菌对常用抗生素的耐药情况有E-test法和取胃粘膜提DNA两种方法。E-test法是一种应用于各种细菌耐药性的检测方法，该法用于检测幽门螺杆菌对常用抗生素耐药情况主要是通过取胃粘膜组织后涂菌环涂菌，2-3天后进行液体培养，将培养好的细菌均匀涂在培养皿上，通过加入不同抗生素贴条，根据贴条刻度判断其耐药情况。但该方法操作复杂，且稳定性差，易受外界条件干扰，因此在临床上未得以广泛应用。而胃粘膜提DNA法主要通过取感染者胃组织，试剂盒提取DNA，PCR扩增后酶切，通过电泳条带判断突变位点，进而判断细菌耐药情况。该法同样存在操作复杂，病人痛苦不愿配合等缺点，因此该法也无法在临床中应用。
技术实现思路
本专利技术目的就在于克服上述缺陷，研究一种检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性试剂盒及其制备方法。本专利技术的技术方案是:检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性试剂盒，其主要技术特征在于该试剂盒由提取粪便DNA试剂，PCR反应试剂，PCR产物纯化试剂和纯化产物酶切试剂组成；具体在于:(1)其中所述的提取粪便DNA试剂包括2X十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，2%巯基乙醇，PBS缓冲液；(2)其中所述的PCR反应试剂包括引物1，引物2，引物3，引物4，TaqPremix(2 X)；(3)其中所述的PCR产物纯化试剂包括4mol/L醋酸铵；(4)其中所述的纯化产物酶切试剂:酶1，酶2。本专利技术的另一技术方案是:检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性试剂盒操作方法，其主要技术特征在于试剂盒的操作方法包括以下步骤:(1)粪便DNA提取:取适量新鲜粪便，经过预处理后，向所得沉淀加入DNA提取试齐U，经过离心，提上清等一系列步骤，可获得DNA产物；(2)PCR反应:向离心管中加入上述提取的DNA、引物1、引物2、Taq Premix (2X)和ddH20，进行两次PCR反应，将得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳条带可判断有无幽门螺杆菌感染；(3) PCR产物纯化:吸取PCR产物置于EP管中，加入等体积醋酸铵、异丙醇溶液后，振荡混匀，经3次乙醇漂洗、离心等步骤后将所得终产物室温下干燥，加20ulddH20，置4°C冰禮备用；(4)纯化产物酶切:向纯化产物中加入酶1，酶2，酶切后取5ul产物琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳条带可判断有无克拉霉素耐药存在。本专利技术的又一技术方案是:检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性试剂盒制备方法，其主要技术步骤在于:制备DNA提取试剂:(1)制备无菌PBS 缓冲液:将 4gNaCl，0.1gKCl，1.7g Na2HPO4.12Η20，0.Ig KH2PO4加Λ 400ml ddH20中，调节Ph至7.4后用ddH20定容至500ml，分装成IOOml后置入试剂盒；(2)制备 2XCTAB 提取液，其 PH 8.0:由 2 % CTAB，1.4MNacl，0.02MEDTA，0.lMTris-cl,0.2 % 巯基乙醇组成，即称取 CTAB 2g 加 ddH2040ml,加 lMTris-cllOml，PH8.0,0.5M EDTA4ml，PH 8.0 和 5M NaCl 28ml，待 CTAB 溶解后用 ddH20 定容到 100ml，提取前加入2%的巯基乙醇，即IOOml加0.2ml巯基乙醇；(3)制备 IM Tris-cl IOOml:在 80ml ddH20 中加入 12.1lg Tris 碱和 4.9mlHCl,三者混匀充分溶解后，滴加浓盐酸调PH至8.0,定容至IOOml ；(4)制备 0.5M EDTAlOOml:在 80mlddH20 中加入 18.0lg EDTANa22H20 搅拌溶解，用NaOH调PH至8.0，约2gNaOH颗粒，定容至IOOml ；(5)制备 5M NaCl IOOml:称取 29.22g NaCl，用 ddH20 定容到 IOOml ；(6)制备 3M NaAclOml:称取 2.46g NaAc，用 ddH20 定容到 IOml ；制备PCR反应试剂:Premix 反应液 2mL:由 IOXPCR 缓冲液 2mL，4 种 dNTP 各 0.2umol, rTaq 酶 2.5U,Mg2+ 0.015mmol 混合组成；制备PCR产物纯化试剂:4mol/L醋酸铵溶液:称取77g无水固体醋酸铵晶体，加入IOOml ddH20,待完全溶解均匀，再用ddH20定容至250ml。本专利技术的优点和效果在于将易获取的宏观物质转化至分子水平进行研究，且将细菌DNA的提取、扩增、纯化、酶切等步骤融合成整体完成，不仅能取得可靠的幽门螺杆菌对克拉霉素耐药结果，并且在检测标本获取上具备操作简便、费用低，病人痛苦小、依从性高等特点，同时检测流程规范、便捷，能够实现广泛应用于临床的幽门螺杆菌耐药性检测。附图说明图1——本专利技术中从粪便提取DNA 0 后进行？0 反应，病人1，7，8，9，10，11，12，13，15，16显示扩增条带示意图。图2-本专利技术中PCR反应阳性后分别用酶I和酶2进行酶切，病人I用酶2后发现2142A-G突变，病人10，11，13用酶1后发现2143八-6突变PCR后酶切示意图。图3——本专利技术试剂盒结构原理示意图，I代表提取粪便DNA试剂，2代表PCR反应试剂。3代表PCR产物纯化试剂，4代表纯化产物酶切试剂。图4——本专利技术1，2，3，4各部分具体结构图。具体实施例方式本专利技术的操作方法，如图1、2、3、4所示:实施例1:提取DNA:包括 PBS 缓中液、Tirs 碱、浓盐酸、EDTANa2.2H20、NaOH、NaCl、CTAB、酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、NaAc、液氮、巯基乙醇、研钵、恒温水浴、离心机、离心管。2.PCR反应:包括引物I，引物2，引物3，引物4，琼脂糖，EB替代物,1 X TAE, Taq Premix (2 X) 0 3.PCR产物纯化:醋酸铵、异丙醇。4.纯化产物酶切:酶1，酶2，琼脂糖，EB替代物，1 XTAE。下面具体说明:粪便DNA提取:取新鲜粪便0.2-0.4g，加入装有6mL无菌PBS缓冲液(0.05mol/L,pH 7.4)试管中充分振荡摇勻5 10min后500rpm离心5min,收集上清液。此步骤重复3次。然后上清液5000rpm离心10min，收集沉淀置于EP管中。沉淀物在1mL ddH20中悬置，混和后14000rpm离心5min收集沉淀。将沉淀溶于200 μ L无水乙醇(_20°C预冷)，振荡混匀后14000rpm离心2min，弃上清，此步骤重复3次。将预处理后所得沉淀转入2mlEP管中，加入600uL,65°C预热的2 X CTAB溶液(用前加入2 %的巯基乙醇)，将装有CTAB和沉淀的EP管放入65 ℃水浴，约lh。冷却后，加入600ul的酚:氯仿:异戊醇(25: 24: 1)，混匀，12000r本文档来自技高网...
【技术保护点】
检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性试剂盒，其特征在于该试剂盒由提取粪便DNA试剂，PCR反应试剂，PCR产物纯化试剂和纯化产物酶切试剂组成；具体在于：(1)其中所述的提取粪便DNA试剂包括2×十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，2％巯基乙醇，PBS缓冲液；(2)其中所述的PCR反应试剂包括引物1，引物2，引物3，引物4，Taq Premix2×；(3)其中所述的PCR产物纯化试剂包括4mol/L醋酸铵；(4)其中所述的纯化产物酶切试剂：酶1，酶2。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张国新，周晓颖，苏静，
申请(专利权)人：张国新， 周晓颖， 苏静，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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