本发明专利技术公开一种可同时检测副溶血弧菌、创伤弧菌和溶藻弧菌的多重PCR检测方法，首先制备被检测物的DNA模板并置于反应管中；将三种弧菌引物放入a步骤的反应管中进行多重PCR反应，引物浓度依次为1~20pmol/μl、1~20pmol/μl、1~30pmol/μl；副溶血弧菌的引物序列为：5’-GCAGCTGATCAAAACGTTGAGT-3’、5’-ATTATCGATCGTGCCACTCAC-3’，创伤弧菌的引物序列为：5’-TTCCAACTTCAAACCGAACTATGAC-3’、5’-ATTCCAGTCGATGCGAATACCGAATACGTTG-3’、溶藻弧菌的引物序列为：5’-CGAGTACAGTCACTTGAAAGCC-3’、5’-CACAACAGAACTCGCGTTACC-3’。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种多重PCR检测方法，尤其是一种耗时短、效率高、灵敏度高，可直接应用于临床的可同时检测副溶血弧菌、创伤弧菌和溶藻弧菌的多重PCR检测方法。
技术介绍
弧菌广泛分布于近岸、河口海区，大多是存在于海水和海洋生物体表及肠道的优势菌群，同时也是引起海水养殖动物细菌性疾病的最重要的病原菌之一。大量的研究和生产实践表明，弧菌病就是由弧菌属细菌引起的一类细菌性疾病，流行广、发病率高，主要的病原弧菌有:溶藻弧菌{Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌{Vibrioparahaemolyticus)、创伤弧菌 iVibrio vulnificus)等 10 多种弧菌。溶藻弧菌可导致对虾败血症；导致黑鲷表皮溃疡、出血、有黑斑，眼球突出、充血，腹部肿胀，肝脏充血，肾脏苍白，脾脏肿大等；导致点带石斑鱼体表有溃疡，鳃、鳍等充血，腹腔积液，肝严重肿大，肾、脾等脏器毛细血管充血等。溶藻弧菌感染的宿主范围还十分广泛，可以通过生食被感染的贝类、鱼类等传染给人类，是沿海地区食物中毒和腹泻的重要病原菌，食物中毒患者可出现腹泻、腹部痉挛、恶心、呕吐、发热，甚至脱水、昏迷等症状。创伤弧菌可感染黄姑鱼、青石斑、鲑点石斑、红鳍笛鲷、鳗鲡等养殖动物，主要症状为患病鱼体表有出血点甚至溃烂，各鳍基部充血、出血、发炎。创伤弧菌也是引起人畜共患病的重要病原菌，该病主要引起原发性败血症和严重的创伤口感染，也可以导致坏死性肠胃炎、脑膜炎、肺炎、角膜炎等病，死亡率超过50%。副溶血弧菌可引起凡纳滨对虾幼虾(体长2 3cm)发生毁灭性死亡，主要症状为运动能力差，摄食能力下降，身体弯曲，体表和附肢上常有大量污物附着，肌肉浑浊、鳃部呈黑色等症状；感染红鳍笛鲷引起的溃疡病、传染性强，患病红鳍笛鲷的症状表现为:体色变浅，胸鳍、尾鳍、腹鳍溃烂，体表溃疡且黏液增多，溃疡周围的鳞片大面积脱落。目前，多重PCR主要应用于可引起人类疾病的弧菌检测，如食品检测等，而在水产动物弧菌病基本上都是沿用普通PCR方法，一次只能检测一种弧菌，检测所需时间长且常常造成漏检或误检。本专利技术是为了解 决现有技术所存在的PCR方法检测水产动物弧菌病致病菌，一次只能检测一种弧菌，检测所需时间长，且常常造成漏检现象的问题，提供一种可以同时检测多种弧菌病致病菌检测的多重PCR方法。
技术实现思路
本专利技术是为了 解决现有技术所存在上述问题，提供一种耗时短、效率高、灵敏度高，可直接应用于临床的可同时检测副溶血弧菌、创伤弧菌和溶藻弧菌的多重PCR检测方法。本专利技术的技术解决方案是:一种可同时检测副溶血弧菌、创伤弧菌和溶藻弧菌的多重PCR检测方法，其特征在于依次按如下步骤进行: a.制备被检测物的DNA模板并置于反应管中； b.将副溶血弧菌、溶藻弧菌和创伤弧菌引物放入a步骤的反应管中进行多重PCR反应，所述副溶血弧菌引物浓度为1~20 pmol/yl，所述创伤弧菌引物浓度为1~20 pmol/ul,所述溶藻弧菌引物浓度为1~30 pmol/ul ； 所述副溶血弧菌的引物序列为: flaE-F:5’ - GCAGCTGATCAAAACGTTGAGT-3’ fIaE-R: 5’ -ATTATCGATCGTGCCACTCAC-3’ 所述创伤弧菌的引物序列为: vvh-F: 5’ -TTCCAACTTCAAACCGAACTATGAC-3’ vvh-R: 5’ -ATTCCAGTCGATGCGAATACGTTG-3’ 所述溶藻弧菌的引物序列为: col-F:5，-CGAGTACAGTCACTTGAAAGCC-3’ col-R:5，-CACAACAGAACTCGCGTTACC-3’所述多重 PCR 反应条件为:94°C预变性 3min ;94°C 30s, 52.0-61°C 30s, 72°C lmin,共32个循环；72°C终延伸7min ； 所述多重PCR反应体系为25 ill:liUDNA模板，2.5iil不含Mg2+的IOXPCR buffer,0.5m 的 IOmM 的 dNTP，2W 的 25mM 的 Mg2+，0.15W 的 Taq 酶(50U)，引物各 I y 1，双蒸水17.85^0所述a步骤的制备被检测物的DNA模板是取水产动物的组织匀浆液置于1.5ml的离心管中，800g离心5min，除去组织碎片取上清置于1.5ml灭菌离心管中；10，OOOg离心IOmin,除去上清液，加入IOOu I 0.1 M的TE缓冲溶液，100°C沸水浴IOmin ； 10，OOOg离心lOmin，上清液即水产动物DNA模板。本专利技术与现有普通PCR检测副溶血弧菌、创伤弧菌和溶藻弧菌技术相比，方法简单、耗时短、成本低廉，引物检测灵敏度高，适于基层检验检疫机构及养殖场操作，对由这三种弧菌引起的弧菌病的监测与预防提供了有效的工具，可有效减少经济损失。附图说明图1是本专利技术实施例1的PCR扩增图。图2是本专利技术实施例2的PCR扩增图。图3是本专利技术实施例3的PCR扩增图。图4是本专利技术实施例4的PCR扩增图。具体实施例方式实施例1: a.以标准的三株自1J溶血弧菌 Vibrio parahaemolyti cus KCTC2471、Vibrioparahaemolyti cus L一0603121^ Vibrio parahaemolyti cus H040823-1 为被检测物，用现有DNA提取方法制备其DNA模板并置于反应管中； b.将副溶血弧菌、溶藻弧菌和创伤弧菌引物放入a步骤的反应管中进行多重PCR反应，所述副溶血弧菌引物浓度为f 20 pmol/yl，所述创伤弧菌引物浓度为广20 pmol/ul,所述溶藻弧菌引物浓度为广30 pmol/ul ； 根据副溶血弧菌flaE基因设计合成的副溶血弧菌引物序列为: flaE-F:5’ - GCAGCTGATCAAAACGTTGAGT-3’ fIaE-R: 5’ -ATTATCGATCGTGCCACTCAC-3’ 根据创伤弧菌vvh基因设计合成的创伤弧菌引物序列为: vvh-F: 5’ -TTCCAACTTCAAACCGAACTATGAC-3’ vvh-R: 5’ -ATTCCAGTCGATGCGAATACGTTG-3’ 根据溶藻弧菌collagenase基因设计合成的溶藻弧菌引物序列为: col-F:5，-CGAGTACAGTCACTTGAAAGCC-3’ col-R:5，-CACAACAGAACTCGCGTTACC-3’所述多重 PCR 反应条件为:94°C预变性 3min ;94°C 30s, 52.0-61°C 30s, 72°C lmin,共32个循环；72°C终延伸7min ； 所述多重PCR反应体系为25 ill:1i IDNA模板，2.5 ill不含Mg2+的IOXPCR buffer,0.5m 的 IOmM 的 dNTP，2W 的 25mM 的 Mg2+，0.15W 的 Taq 酶(50U)，引物各 I y 1，双蒸水17.85^0检测结果如图1所示，图1中M: DNA marker ；1:阴性对照；2_4:副溶血弧菌扩增产物。结果表明本专利技术实施例1的方法可扩增出目的条带。实施例2: 多本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可同时检测副溶血弧菌、创伤弧菌和溶藻弧菌的多重PCR检测方法，其特征在于依次按如下步骤进行：a. 制备被检测物的DNA模板并置于反应管中；b. 将副溶血弧菌、溶藻弧菌和创伤弧菌引物放入a步骤的反应管中进行多重PCR 反应，所述副溶血弧菌引物浓度为1~20 pmol/μl，所述创伤弧菌引物浓度为1~20 pmol/μl，所述溶藻弧菌引物浓度为1~30 pmol/μl；所述副溶血弧菌的引物序列为：flaE‑F:5’‑ GCAGCTGATCAAAACGTTGAGT‑3’flaE‑R: 5’‑ATTATCGATCGTGCCACTCAC‑3’所述创伤弧菌的引物序列为： vvh‑F: 5’‑TTCCAACTTCAAACCGAACTATGAC‑3’ vvh‑R: 5’‑ATTCCAGTCGATGCGAATACGTTG‑3’所述溶藻弧菌的引物序列为： col‑F：5’‑CGAGTACAGTCACTTGAAAGCC‑3’col‑R：5’‑CACAACAGAACTCGCGTTACC‑3’所述多重PCR 反应条件为：94℃预变性3min；94℃ 30s，52.0‑61℃ 30s，72℃ 1min，共32个循环；72℃终延伸7min； 所述多重PCR反应体系为25μl：1μlDNA模板，2.5μl不含Mg2+的10×PCR buffer，0.5µl的10mM的dNTP，2µl的25mM的Mg2+，0.15µl的Taq酶（50U），引物各1μl，双蒸水17.85µl。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李华，李强，冯春明，叶仕根，王轶南，
申请(专利权)人：大连海洋大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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