一种神经氨酸酶抑制剂在制备抗H1N1流感病毒药物方面的应用制造技术

本发明专利技术属于抗病毒药物技术领域，具体为一种神经氨酸酶抑制剂在制备抗H1N1流感病毒药物方面的应用。发明专利技术中的神经氨酸酶抑制剂具有抑制流感病毒H1N1神经氨酸酶的活性。所述的病毒神经氨酸酶为在MDCK细胞中重组表达的A/WSN/33 H1N1神经氨酸酶。本发明专利技术的有益效果在于：神经氨酸酶抑制剂具有抗高致病性禽流感病毒的应用，且毒性较小，潜在药用价值较高。

【技术实现步骤摘要】
一种神经氨酸酶抑制剂在制备抗H1N1流感病毒药物方面的应用
本专利技术涉及抗病毒药物
，具体地说是一种神经氨酸酶抑制剂在制备抗H1N1流感病毒药物方面的应用。
技术介绍
H1N1亚型流感病毒是甲型流感病毒中的一种，属于正黏病毒科，为负链RNA病毒。根据血清学溯源，H1N1病毒来源于猪型Hsw1N1流感病毒，最早是在1933年由英国人威尔逊·史密斯发现的。神经氨酸酶也称唾液酸酶，是流感病毒被膜上的一种糖蛋白，其酶学代码为EC3.2.1.18。它具有水解唾液酸的活性，从而能够切断病毒与宿主细胞的联系，形成新的感染，在病毒生理周期中的作用已被系统研究和广泛关注。神经氨酸酶抑制剂是目前应用最广泛的抗流感药物之一，已上市的该类药物主要有zanamivir和oseltamivir。但扎那米韦口服利用度低，肾脏清除快，体内分布容积小，只能作为局部用药。奥司他韦是抗流感特效药，经受了禽流感和甲型H1N1流感的双重考验。因此近年来文献报道的新型神经氨酸酶抑制剂以奥司他韦类似物为主。为了增强新药的临床效果，目前研究人员加大了对神经氨酸酶抑制剂活性的检测力度。如Hong等人对一系列奥司他韦异羟肟酸类药物进行了EC50、IC50和CC50的测试(Bioorgan.Med.Chem.2014,22(23):6647)。最近研究结果证明，当以奥司他韦为底物时，其联苯类取代化合物对多种亚型流感病毒抑制活性较好(J.Med.Chem.2014,57(20):8445-58)。该类抑制剂是一种具开发潜力的抗病毒药物资源。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种神经氨酸酶抑制剂在制备抗H1N1流感病毒药物方面的应用。神经氨酸酶为在MDCK细胞中重组表达的高致病流感病毒A/WSN/33H1N1神经氨酸酶。本专利技术的神经氨酸酶抑制剂用于抗致病性流感病毒危害的活性较优。本专利技术提供一种神经氨酸酶抑制剂在制备抗H1N1流感病毒药物方面的应用，所述神经氨酸酶抑制剂具有式I所示结构：和现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：本专利技术中的神经氨酸酶抑制剂具有优异的抗H1N1流感病毒性能。其半毒性浓度(CC50值)为373μM，半抑制浓度(IC50值)为1.72μM，对A/WSN/33H1N1病毒株有较好抑制效果。且毒性较小，其选择指数217(SI＝CC50/IC50)较高。附图说明图1为神经氨酸酶抑制剂活性(CC50&IC50)测定曲线图。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术进一步详细描述，本专利技术技术方案不局限于以下所列举的具体实施方式，本专利技术所用试剂来自中国科学院上海巴斯德研究所。实施例所用试剂和实验仪器：细胞维持液：DMEM+10％PBS+1％P/S；细胞感染液：DMEM+0.3％BSA+25mMHEPES+1μg/ml胰酶；LuminescentCellViabilityAssay(promega)；酶标仪。流感病毒TCID50由ReedMuench方法得到。一种神经氨酸酶抑制剂抗H1N1流感病毒活性测试具有如下步骤：(1)将终浓度为1×105细胞/毫升的MDCK细胞接种于白底96孔细胞培养板中，置于37℃培养箱中过夜。待细胞长成单层后，弃掉原培养液，将化合物用感染液倍比稀释成不同浓度，加入96孔板中，每孔100μl，每个浓度5个复孔。其中只加0.1ml感染液的细胞为正常对照组。置于37℃、5％CO2培养箱72小时后从培养箱中取出使之降至室温，每孔加入25μl的试剂，避光震荡3min混匀后静置10min。置于酶标仪读数，记录荧光(Luminescence)数值，求出化合物对细胞CC50值和无毒界限浓度(MNCC)；细胞存活率％＝试验孔Luminescence值/细胞对照孔Luminescence值×100％。(2)将终浓度为1×105细胞/毫升的MDCK细胞接种于白底96孔细胞培养板中，置于37℃培养箱中过夜。待细胞长成单层后，弃掉原培养液，同时加入20TCID50/50μl的A/WSN/33H1N1流感病毒悬液和50μl以不超过MNCC(无毒界限浓度)为最高浓度倍比稀释后的样品溶液，每个浓度5个复孔。同时设正常细胞对照组、病毒对照组。96孔细胞培养板置于37℃、5％CO2培养箱内，每天在显微镜下观察有病毒引起的CPE(cytopathiceffects)。当病毒对照组出现75％-100％CPE时从培养箱中取出。读数方法同CC50。求出化合物对细胞病变的半抑制浓度(IC50)和选择指数(SI＝CC50/IC50)。对目标化合物进行生物活性测试，利用GraphPadPrism6软件绘制出抑制剂加入量对神经氨酸酶活性的曲线图，确定化合物的CC50和IC50值。得到其半毒性浓度(CC50值)为373μM，半抑制浓度(IC50值)为1.72μM，对A/WSN/33H1N1病毒株有较好抑制效果。且毒性较小，其选择指数217(SI＝CC50/IC50)较高，阳性对照奥司他韦IC50＝0.579μM，CC50>500μM。表1对化合物的半毒性浓度(CC50值)测试数据，表2对化合物的半抑制浓度(IC50)测试数据。表1对化合物的半毒性浓度(CC50值)测试数据表2对化合物的半抑制浓度(IC50)测试数据从表1中可以看出，当化合物浓度分别为12.5,6.25,3.125,1.5625和0.78125μM时，抑制剂半毒性浓度分别为3.36％,17.94％,20.44％,35.80％和66.02％。从表2中可以看出，当化合物浓度分别为3.125,1.5625,0.78125,0.39063,0.19531,0.09766μM时，化合物的抑制率为105.80％,78.89％,53.42％,36.73％,26.75％和24.25％。表中数据为对应细胞数量。各个浓度下，对化合物的半毒性浓度测试数据和半抑制浓度测试数据列于其中。利用GraphPadPrism6软件绘制出抑制剂加入量对神经氨酸酶活性的曲线，得到化合物的CC50和IC50值。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种神经氨酸酶抑制剂在制备抗H1N1流感病毒药物方面的应用，所述神经氨酸酶抑制剂具有式I所示结构：

【技术特征摘要】
1.一种神经氨酸酶抑制剂在制备抗H1N1流感病毒药...

【专利技术属性】
技术研发人员：程利平，王震，
申请(专利权)人：上海应用技术大学，
类型：发明
国别省市：上海,31