一种酪氨酸酶抑制剂或促进剂的筛选方法技术

本发明专利技术涉及一种酶抑制剂或促进剂的筛选方法，具体涉及一种利用薄层色谱生物自显影技术筛选酪氨酸酶抑制剂或促进剂的方法，包括如下步骤：(1)将供试品溶解于有机溶剂中，然后将供试品溶液点样于薄层板上，挥干溶剂，备用；(2)将步骤(1)得到的薄层板浸渍于酪氨酸酶溶液中，挥干溶剂后再浸渍于1～20mmol/L的左旋多巴磷酸缓冲盐溶液中，取出薄层板后在20℃～40℃下进行酶促反应；(3)根据酶促反应后薄层板上的斑点颜色筛选供试品。本发明专利技术的方法不需要复杂的仪器和设备，操作简单，实验耗费低，适合一般实验室操作，而且灵敏度和专属性高于常规筛选方法，筛选结果直观、易于辨识和记忆。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种酶抑制剂或促进剂的筛选方法，具体涉及一种筛选酪氨酸酶抑制剂或促进剂的方法。
技术介绍
酪氨酸酶是一种含铜酶，广泛存在于微生物、动植物及人体中。具有独特的双重催化功能，是黑色素代谢和儿茶酚胺的关键酶，并且是白癜风自身免疫的重要抗原。酪氨酸酶能催化L-酪氨酸和L-多巴氧化生成黑色素。酪氨酸酶作为黑色素合成的关键酶，其异常过量表达可导致人体的色素沉着性疾病，果蔬褐变。酪氨酸酶抑制剂可以治疗目前常见的色素沉着皮肤病如雀斑、黄褐斑、老年斑，也被用作食品保鲜剂。酪氨酸酶促进剂可以用于治疗白癜风。酪氨酸酶也与昆虫蜕皮过程中的鞣化作用有关。鉴于酪氨酸酶的广泛应用，国内外很多学者致力于寻找具有特异的、高效的酪氨酸酶抑制剂或促进剂的研究方法，及其作用机理、动力学原理和如何应用。目前临床上使用的酪氨酸酶抑制剂都有比较大的毒副作用。曲酸和维生素C虽然对酪氨酸酶有较强的抑制作用，但它们相对较不稳定，保质期较短；果酸对人体皮肤有较大的刺激作用，也不受人们的好评；动物胎盘提取液、芦荟提取液成本高而且成分较复杂且易变质，也有一定的不足之处。白癜风目前还没有确定显著疗效的药物,所以酪氨酸酶的抑制剂或促进剂在生物、农学、药学和医学等研究领域有着重要的意义。从天然药物中寻找有效、低毒、价廉的酪氨酸酶抑制剂或促进剂更是成为目前酪氨酸酶研究的主要方向。传统的酪氨酸酶抑制剂或促进活性筛选方法都要求化合物从中药中分离、提纯出来并且需要足够大的量，通过体内外多种实验方法评价药用样品的活性，但是许多从中药中得到的天然化合物却难以满足这些条件。薄层色谱—生物自显影技术可以弥补以上技术的不足。薄层色谱—生物自显影是一种将薄层色谱分离和生物活性测定相结合的药物筛选方法，具有操作简单、实验耗费低、灵敏度和专属性高以及可以实现对生物活性的快速测定的特点。SakulnaWangthong等人采用的酪氨酸酶抑制剂筛选方法是以L-酪氨酸为底物。每块板以喷雾法使每平方厘米含20ul的100U-200U/ml的酪氨酸酶和200ul的2×10-3-3×10-3mM的L-酪氨酸，反应10min后显示出效果。其曲酸的最低检测线为0.020ug(WangthongS,TonsiripakdeeI,MonhapholT,etal.PostTLCdevelopingtechniquefortyrosinaseinhibitordetection.BiomedicalChromatography,2007,21(1):94-100)。其不足之处在于：反应灵敏度偏低，反应时间偏长。此外，其采用喷雾法操作不易掌握。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供了一种快速筛选复杂天然产物或者单体化合物中酪氨酸酶抑制剂或促进剂的方法。该方法具有操作简单、实验耗费低、灵敏度和专属性高以及能够在复杂体系中对样品的生物活性进行快速测定的特点。本专利技术的技术方案为：采用薄层色谱—生物自显影技术建立酪氨酸酶抑制剂或促进剂的活性筛选方法，该方法能够高通量地筛选不同实验室的不同样品的抑制或促进酪氨酸酶的活性。该方法以色彩图像形式提供结果，形象直观，易于辨认和记忆；该方法以薄层板作为媒介，不受溶剂和样品浓度的限制，因此受试样品的范围比紫外分光光度法更为广泛。本专利技术的酪氨酸酶—薄层色谱生物自显影技术是一种将薄层色谱分离和生物活性测定相结合的药物筛选方法，基于酪氨酸酶和底物通过酶促反应会产生灰黑色的反应产物——黑色素(melanin)，抑制或促进酪氨酸酶活性的物质正是通过抑制或促进该反应的发生，从而在薄层板上表现为灰黑色背景下的白色或深黑色斑点。具体而言，本专利技术提供了一种酪氨酸酶抑制剂或促进剂的筛选方法，所述方法包括如下步骤：(1)将供试品溶解于有机溶剂中，然后将供试品溶液点样于薄层板上，挥干溶剂，备用；(2)将步骤(1)得到的薄层板浸渍于酪氨酸酶溶液中，挥干溶剂后再浸渍于1～20mM/L的左旋多巴(L-DOPA)磷酸缓冲盐溶液中，取出薄层板后在20℃～40℃条件下进行酶促反应；(3)根据酶促反应后薄层板上的斑点颜色筛选供试品。在一优选例中，所述步骤(1)中还包括将点样于薄层板上的供试品在展开剂中展开的步骤。在另一优选例中，所述展开剂选自石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、甲醇、乙醇、乙酸、氨水和醋酸铵中的一种或一种以上。在另一优选例中，所述供试品溶液的浓度为0.001mg/ml～200mg/ml，所述供试品溶液的点样量为1～20μL。在另一优选例中，所述薄层板为硅胶板。在另一优选例中，所述酪氨酸酶溶液可由如下方法制得：将酪氨酸酶直接溶于pH值为6.0～8.0的20mmol/L的磷酸盐缓冲液，配制成酪氨酸酶浓度为50～300U/mL的酪氨酸酶溶液。在另一优选例中，所述酶促反应的时间为5～40分钟。在另一优选例中，所述步骤(3)包括：酶促反应后，若在所述薄层板的灰黑色背景下出现白色斑点，则所述供试品为酪氨酸酶抑制剂；若在所述薄层板的灰黑色背景下出现深黑色斑点，则所述供试品为酪氨酸酶促进剂。相对于现有技术，本专利技术的方法具有如下优点：(1)操作简单，实验耗费低，不需要复杂的仪器和设备；(2)以色彩图像形式提供结果，形象直观，易于辨认和记忆；(3)以薄层板作为媒介，不受溶剂和样品浓度的限制，因此受试样品的种类比紫外分光光度法更为广泛；(4)以反应自身为底色，实验步骤简单，误差因素少；(5)薄层色谱具有分离功能，对于混合物或者植物提取物，能够先对其进行分离后再检测。本专利技术各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本专利技术的特点、目的和优势将更为明显。附图说明图1为实施例1中利用酪氨酸酶—薄层色谱生物自显影技术对曲酸的活性检测结果图。图2为实施例2中利用酪氨酸酶—薄层色谱生物自显影技术对不同浓度曲酸活性检测的结果图(1为效果图，2为扫描结果图，3数据图)。图3为实施例3中利用酪氨酸酶—薄层色谱生物自显影技术对维生素C的活性检测结果图(1为曲酸样品，2为维生素C样品)。图4为实施例4中利用酪氨酸酶—薄层色谱生物自显影技术对木犀草素的活性检测结果图(1为曲酸样品，2为木犀草素样品)。图5为实施例5中利用酪氨酸酶—薄层色谱生物自显影技术对白茯苓的活性检测结果图(1为曲酸样品，2为白茯苓样品)。图6为实施例6中利用酪氨酸酶—薄层色谱生物自显影技术对红景天乙酸乙酯部分提取物的筛选结果图。图7为实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酪氨酸酶抑制剂或促进剂的筛选方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)将供试品溶解于有机溶剂中，然后将供试品溶液点样于薄层板上，挥干溶剂，备用；(2)将步骤(1)得到的薄层板浸渍于酪氨酸酶溶液中，挥干溶剂后再浸渍于1～20mmol/L的左旋多巴磷酸缓冲盐溶液中，取出薄层板后在20℃～40℃下进行酶促反应；(3)根据酶促反应后薄层板上的斑点颜色筛选供试品。

【技术特征摘要】
1.一种酪氨酸酶抑制剂或促进剂的筛选方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将供试品溶解于有机溶剂中，然后将供试品溶液点样于薄层板上，挥干溶剂，备用；
(2)将步骤(1)得到的薄层板浸渍于酪氨酸酶溶液中，挥干溶剂后再浸渍于1～20mmol/L
的左旋多巴磷酸缓冲盐溶液中，取出薄层板后在20℃～40℃下进行酶促反应；
(3)根据酶促反应后薄层板上的斑点颜色筛选供试品。
2.如权利要求1所述的酪氨酸酶抑制剂或促进剂的筛选方法，其特征在于，所述步骤(1)
中还包括将点样于薄层板上的供试品在展开剂中展开的步骤。
3.如权利要求2所述的酪氨酸酶抑制或促进剂的筛选方法，其特征在于，所述展开剂选
自石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、甲醇、乙醇、乙酸、氨水和醋酸铵中的一种或一种
以上。
4.如权利要求1或2或3所述的酪氨酸酶抑制剂或促进剂的筛选方法，其特征在于，所
述供试品溶液的浓度为0.001mg\...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴弢，周金阁，廖立平，林艺青，
申请(专利权)人：上海中医药大学，片仔癀上海生物科技研发有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31