一种从茶花粉中快速分离酪氨酸酶抑制剂的方法技术

本发明专利技术公开了一种从茶花粉中快速分离酪氨酸酶抑制剂的方法，主要包括如下步骤：以茶花粉为原料，经过提取、萃取、高速逆流色谱纯化和干燥得到茶花粉酪氨酸酶抑制剂，它对酪氨酸酶具有高效抑制作用，IC50值为41.57μg/mL。本发明专利技术方法快速简单，原料天然、无毒，所得产物的抑制活性强，因此利用HSCCC从茶花粉开发天然酪氨酸酶抑制剂，用于美白化妆品、预防和治疗由于人体黑色素过多导致的沉着性疾病，具有很好的商业前景。

【技术实现步骤摘要】
一种从茶花粉中快速分离酪氨酸酶抑制剂的方法
本专利技术涉及生物制品分离纯化的
，尤其涉及一种从茶花粉中快速分离酪氨酸酶抑制剂的方法。
技术介绍
酪氨酸酶又称酚氧化酶、多酚氧化酶、儿茶酚氧化酶，是结构复杂的多亚基的含铜氧化还原酶，广泛存在于微生物、动植物及人体中。它是生物体内催化黑色素生成的关键限速酶，而且与果蔬褐化、人体色素沉着性疾病(如雀斑、黄褐斑、老年斑等)及黑色素瘤的发生与治疗有重要关系。酪氨酸酶抑制剂可通过抑制酪氨酸酶的活性来切断黑色素的生物合成反应链，以此达到阻碍黑色素生成、防止果蔬褐变等目的。目前酪氨酸酶抑制剂已广泛应用于美白护肤化妆品、害虫调控剂以及食品添加剂等各个方面。因此，对医药、化妆品和食品工业等多个领域而言，酪氨酸酶抑制成分的研究与开发均具有重要的理论价值和广阔的应用前景。当前，酪氨酸酶抑制剂的来源以有机合成、商品化合物筛选以及天然植物或微生物次级代谢产物的分离提取三个途径为主。鉴于化学合成产物具有毒副作用强、成本较高、操作难度大等弊端，寻求天然来源的酪氨酸酶抑制剂仍然是引起食品科学家和药物化学家高度兴趣的研究课题。蜂花粉能够防治脑心血管疾病，降血脂，调节神经系统功能，在调节内分泌、提高机体免疫功能、抗衰老等方面有一定的效果。茶花粉是蜂花粉中的上品，不仅口感好、营养物质含量丰富，而且具有深层保养或改善肌肤的功效，能有效预防皮肤的各种不良现象，增强皮肤活力。目前国内外对蜂花粉中酪氨酸酶抑制活性的研究仍停留在粗提物水平，运用HSCCC快速分离制备茶花粉酪氨酸酶抑制成分的研究还未见报道。有鉴于此，本专利技术人研究和设计了一种从茶花粉中快速分离酪氨酸酶抑制剂的方法，本案由此产生。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种从茶花粉中快速分离酪氨酸酶抑制剂的方法，以茶花粉为原料，经提取、萃取处理后，采用高速逆流色谱(HSCCC，high-speedcounter-currentchromatography)制备分离，收集组分，以获得活性高的酪氨酸酶抑制剂。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种从茶花粉中快速分离酪氨酸酶抑制剂的方法，包括以下步骤：步骤一、提取：将茶花粉干燥、粉碎，按料液比(W/V)1:10加入80％的乙醇水溶液，50℃水浴恒温提取3次，每次6h，过滤，滤液合并，于50℃下减压浓缩成浸膏，得到粗提物；步骤二、萃取：粗提物按料液比(W/V)1:5～1:12加入蒸馏水，搅拌溶解，加入石油醚萃取2～5次，分离，在40～60℃下减压蒸发除去溶剂，得到石油醚萃取物；水层继续用乙酸乙酯萃取3～5次，分离，在40～60℃下减压蒸发除去溶剂，干燥得到乙酸乙酯萃取物；步骤三、HSCCC纯化：配制乙酸乙酯：正丁醇：水溶剂体系，体积比为1:1:10，充分摇匀后超声脱气，将其作为固定相以15～30ml/min流速泵入高速逆流色谱仪，待其充满整个柱子后，调节逆流色谱仪转速至800～900rpm，同时以4～6mL/min流速将流动相按以下顺序依次泵入HSCCC主机螺旋管内：200～400mL的正己烷：乙酸乙酯体系，体积比为1:1；200～400mL的正己烷：乙酸乙酯体系，体积比为1:4；200～400mL的正丁醇：乙酸乙酯体系，体积比为1:4；300～600mL的正丁醇：乙酸乙酯体系，体积比为2:1；泵入流动相的同时将溶有1g乙酸乙酯萃取物的上相泵入主机螺旋管，通过紫外检测器检测流出物，检测波长为254nm，按照色谱峰收集相应的峰组分并减压干燥，得到酪氨酸酶抑制剂。作为实施例的优选方式，所述步骤二中，粗提物按料液比(W/V)1:9加入蒸馏水，搅拌溶解，加入石油醚萃取2次，分离，在40℃下减压蒸发除去溶剂，得到石油醚萃取物；水层继续用乙酸乙酯萃取4次，分离，在40℃下减压蒸发除去溶剂，干燥得到乙酸乙酯萃取物。作为实施例的优选方式，所述步骤三中，配制乙酸乙酯：正丁醇：水溶剂体系，体积比为1:1:10，充分摇匀后超声脱气，将其作为固定相以25ml/min流速泵入高速逆流色谱仪，待其充满整个柱子后，调节逆流色谱仪转速至800rpm，同时以5mL/min流速将流动相按以下顺序依次泵入HSCCC主机螺旋管内：200mL的正己烷：乙酸乙酯体系，体积比为1:1；200mL的正己烷：乙酸乙酯体系，体积比为1:4；200mL的正丁醇：乙酸乙酯体系，体积比为1:4；500mL的正丁醇：乙酸乙酯体系，体积比为2:1；泵入流动相的同时将溶有1g乙酸乙酯萃取物的上相泵入主机螺旋管，通过紫外检测器检测流出物，检测波长为254nm，按照色谱峰收集相应的峰组分并减压干燥，得到酪氨酸酶抑制剂。作为实施例的优选方式，所述步骤三中，HSCCC纯化采用梯度洗脱的方式对样品进行洗脱，四个阶段的流动相依次为：200～400mL的正己烷：乙酸乙酯体系，体积比为1:1；200～400mL的正己烷：乙酸乙酯体系，体积比为1:4；200～400mL的正丁醇：乙酸乙酯体系，体积比为1:4；300～600mL的正丁醇：乙酸乙酯体系，体积比为2:1。作为实施例的优选方式，所述步骤三中，HSCCC纯化所用的乙酸乙酯萃取物用10～20mL的固定相溶解。采用本专利技术的技术方案后，具有以下有益效果：1、本专利技术中HSCCC可以快速有效地制备茶花粉中的酪氨酸酶抑制剂；2、本专利技术工艺操作简单，易实施，产品活性高；3、本专利技术所用茶花粉来源广泛，分离组分具有显著的抑制酪氨酸酶活性的作用且无毒副作用、安全性高，能够应用于美白化妆品、预防和治疗由于人体黑色素过多导致的沉着性疾病。附图说明图1为高速逆流色谱分离纯化茶花粉酪氨酸酶抑制剂的色谱图，收集图中阴影部分并减压浓缩干燥即得茶花粉中抑制酪氨酸酶的有效成分；图2为本专利技术8个实施例分离组分对酪氨酸酶的抑制作用。具体实施方式以下结合附图和具体实施方式以对本专利技术作进一步说明。其中酪氨酸酶活性的测试以L-酪氨酸为底物，具体方法如下：将从茶花粉中提取酪氨酸酶抑制剂溶解于蒸馏水中，取80μl上述溶液，加入pH6.8，0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)112μL，20μL酪氨酸酶溶液，37℃水10min，再加入0.03％L-酪氨酸溶液200μL于37℃反应10min，在475nm下测定吸光值。酪氨酸酶抑制率计算如下：酪氨酸酶抑制率(％)＝[(a-b)-(c-d)]/[a-b]×100％a：未加提取物而加酶的混合液所测的吸光度；b：未加提取物也未加酶的混合液所测的吸光度；c：加提取物和酶的混合液所测的吸光度；d：加提取物而未加酶的混合液所测的吸光度。半抑制浓度(IC50)值得是对酪氨酸酶活性的抑制率达到50％时所需的样品浓度。实施例1第一步，提取：取粉碎干燥的茶花粉500g，按1:10的料液比加入80％的乙醇溶液，50℃水浴恒温浸提6h，共提取3次，提取后过滤，合并滤液并于50℃真空浓缩成浸膏，得茶花粉粗提物148.76g；第二步，萃取：粗提物按料液比(W/V)1:5加入蒸馏水，搅拌溶解，加入石油醚萃取3次，分离，在40℃下减压蒸发除去溶剂，得到石油醚萃取物31.39g；水层继续用乙酸乙酯萃取3次，分离，在40℃下减压蒸发除去溶剂，干燥得到乙酸乙酯萃取物9.21g；第三步，HSCCC纯化：配制乙酸乙酯：正丁醇：水(1:1:10)溶剂体系本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从茶花粉中快速分离酪氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、提取：将茶花粉干燥、粉碎，按料液比(W/V)1:10加入80％的乙醇水溶液，50℃水浴恒温提取3次，每次6h，过滤，滤液合并，于50℃下减压浓缩成浸膏，得到粗提物；步骤二、萃取：粗提物按料液比(W/V)1:5～1:12加入蒸馏水，搅拌溶解，加入石油醚萃取2～5次，分离，在40～60℃下减压蒸发除去溶剂，得到石油醚萃取物；水层继续用乙酸乙酯萃取3～5次，分离，在40～60℃下减压蒸发除去溶剂，干燥得到乙酸乙酯萃取物；步骤三、HSCCC纯化：配制乙酸乙酯：正丁醇：水溶剂体系，体积比为1:1:10，充分摇匀后超声脱气，将其作为固定相以15～30ml/min流速泵入高速逆流色谱仪，待其充满整个柱子后，调节逆流色谱仪转速至800～900rpm，同时以4～6mL/min流速将流动相按以下顺序依次泵入HSCCC主机螺旋管内：200～400mL的正己烷：乙酸乙酯体系，体积比为1:1；200～400mL的正己烷：乙酸乙酯体系，体积比为1:4；200～400mL的正丁醇：乙酸乙酯体系，体积比为1:4；300～600mL的正丁醇：乙酸乙酯体系，体积比为2:1；泵入流动相的同时将溶有1g乙酸乙酯萃取物的上相泵入主机螺旋管，通过紫外检测器检测流出物，检测波长为254nm，按照色谱峰收集相应的峰组分并减压干燥，得到酪氨酸酶抑制剂。...

【技术特征摘要】
1.一种从茶花粉中快速分离酪氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、提取：将茶花粉干燥、粉碎，按料液比(W/V)1:10加入80％的乙醇水溶液，50℃水浴恒温提取3次，每次6h，过滤，滤液合并，于50℃下减压浓缩成浸膏，得到粗提物；步骤二、萃取：粗提物按料液比(W/V)1:5～1:12加入蒸馏水，搅拌溶解，加入石油醚萃取2～5次，分离，在40～60℃下减压蒸发除去溶剂，得到石油醚萃取物；水层继续用乙酸乙酯萃取3～5次，分离，在40～60℃下减压蒸发除去溶剂，干燥得到乙酸乙酯萃取物；步骤三、HSCCC纯化：配制乙酸乙酯：正丁醇：水溶剂体系，体积比为1:1:10，充分摇匀后超声脱气，将其作为固定相以15～30ml/min流速泵入高速逆流色谱仪，待其充满整个柱子后，调节逆流色谱仪转速至800～900rpm，同时以4～6mL/min流速将流动相按以下顺序依次泵入HSCCC主机螺旋管内：200～400mL的正己烷：乙酸乙酯体系，体积比为1:1；200～400mL的正己烷：乙酸乙酯体系，体积比为1:4；200～400mL的正丁醇：乙酸乙酯体系，体积比为1:4；300～600mL的正丁醇：乙酸乙酯体系，体积比为2:1；泵入流动相的同时将溶有1g乙酸乙酯萃取物的上相泵入主机螺旋管，通过紫外检测器检测流出物，检测波长为254nm，按照色谱峰收集相应的峰组分并减压干燥，得到酪氨酸酶抑制剂。2.如权利要求1所述的一种从茶花粉中快速分离酪氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于：所述步骤二中，粗提物按料液比(W/V)1:9加入蒸馏水，搅拌溶解，加入石油醚萃取2次，分离，在40℃下减压蒸发...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨远帆，赖小燕，倪辉，杜希萍，伍菱，陈艳红，姜泽东，李利君，傅佳愈，蔡慧农，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：福建;35